ADAM8對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響及其肽抑制劑治療哮喘動(dòng)物模型的研究.pdf

1、哮喘病是一種常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病,更是對(duì)人類(lèi)健康最具危害的非傳染性重大疾病之一。然而哮喘的發(fā)病機(jī)制至今尚未被完全揭示,這也是臨床上對(duì)哮喘始終缺乏有效治愈方法的根本原因。一般認(rèn)為哮喘病理機(jī)制涉及氣道炎癥、氣道組織重構(gòu)和氣道高反應(yīng)性(Airway Hyperresponsiveness,AHR)等諸多復(fù)雜因素。在這些病理因素中,氣道炎癥被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的重要病理基礎(chǔ),其最顯著的特征是氣道內(nèi)存在大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此,炎癥細(xì)胞從血管系統(tǒng)中被

2、招募并遷移至氣道的過(guò)程,對(duì)于哮喘氣道炎癥乃至整個(gè)哮喘的發(fā)病是至關(guān)重要的,但這一過(guò)程的調(diào)控機(jī)制尚未被解釋清楚。已有相關(guān)研究提示,解整合素金屬蛋白酶8(A Disintegrin and Metalloprotease 8,ADAM8)在這個(gè)過(guò)程中扮演著重要的角色:ADAM8被證實(shí)是一個(gè)與中度到重度過(guò)敏性哮喘極為相關(guān)的哮喘易感基因,其mRNA的表達(dá)在哮喘患者的唾液、支氣管活檢組織和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏性哮喘小鼠的肺組織

3、中被發(fā)現(xiàn)有顯著增高;ADAM8可被炎癥刺激物誘導(dǎo)表達(dá),且在體外被證實(shí)可參與多種炎癥因子、細(xì)胞粘附因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的催化或降解;由于ADAM8在哮喘肺組織中主要高表達(dá)在支氣管、微血管周?chē)难装Y細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞中,因此ADAM8被認(rèn)為可能通過(guò)調(diào)控炎癥細(xì)胞在氣道組織中的招募和遷移,參與到哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中。盡管有關(guān)ADAM8基因敲除型哮喘小鼠的研究結(jié)果提示,ADAM8是一個(gè)潛在的哮喘治療藥物靶點(diǎn),然而對(duì)于ADAM8在哮喘氣道炎癥

4、中究竟是促進(jìn)了還是抑制了炎癥細(xì)胞的招募這一問(wèn)題,學(xué)術(shù)界仍存有較大的爭(zhēng)議,且目前相關(guān)研究主要集中在動(dòng)物模型層次,缺少一個(gè)細(xì)胞水平的系統(tǒng)性研究。另一方面,在這些炎癥細(xì)胞中,巨噬細(xì)胞具有參與宿主防御、吞噬細(xì)胞凋亡殘?bào)w和促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞在氣道中的早期招募等功能,在哮喘氣道炎癥中起到了至關(guān)重要的作用;前期研究提示ADAM8可能通過(guò)參與巨噬細(xì)胞與病原體的接觸從而影響了其活性、粘附能力、吞噬能力等生理功能,然而有關(guān)ADAM8對(duì)巨噬細(xì)胞生理功能的影響及

5、其潛在的力學(xué)調(diào)控機(jī)制,目前尚未見(jiàn)系統(tǒng)性的報(bào)道。這些問(wèn)題的存在阻礙了我們對(duì)ADAM8參與哮喘氣道炎癥機(jī)制的理解,并制約了ADAM8作為藥物靶點(diǎn)用于哮喘治療的可能性。
　　因此,為了闡述清楚ADAM8的表達(dá)對(duì)于巨噬細(xì)胞生理功能的影響及其潛在的力學(xué)機(jī)制,進(jìn)一步理解ADAM8在炎癥細(xì)胞遷移中所扮演的角色,并探索一個(gè)以ADAM8為藥物靶點(diǎn)的哮喘治療新方法,本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控了ADAM8在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),并檢測(cè)了ADAM8超表達(dá)或

6、沉默時(shí),巨噬細(xì)胞在非激活狀態(tài)或免疫激活狀態(tài)(通過(guò)Lipopolysaccharide,即LPS誘導(dǎo)激活)下其活性、粘附、遷移、吞噬、凋亡等生物學(xué)行為以及硬度、收縮力、流變性質(zhì)等力學(xué)行為的變化,并在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證了一種針對(duì)ADAM8設(shè)計(jì)的特異性肽抑制劑在OVA致敏性小鼠哮喘模型中的治療作用。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1)調(diào)控ADAM8基因的表達(dá)改變了巨噬細(xì)胞遷移、粘附、增殖和吞噬的能力,但不影響巨噬細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡過(guò)程。構(gòu)建ADA

7、M8基因超表達(dá)和干擾慢病毒重組載體,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將ADAM8在巨噬細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)水平分別提高了2倍至3倍或下降了60％至70%。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),無(wú)論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達(dá)均促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的活性及其增殖能力,其中在72h處分別提高約20%和40%(P<0.05);無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞的活性均沒(méi)有影響。通過(guò)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),提高ADAM8的表

8、達(dá)對(duì)經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的能力有促進(jìn)作用,可提高約20%(P<0.05),而對(duì)未經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞的粘附能力沒(méi)有影響;無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達(dá)均降低了巨噬細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附,分別下降約30%和40%(P<0.05);通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),無(wú)論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達(dá)均促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的側(cè)向遷移能力,分別提高約30%和20%(P<0.05);無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制

9、ADAM8的表達(dá)均降低了巨噬細(xì)胞的側(cè)向遷移能力,分別下降約40%(P<0.01)和30%(P<0.05)。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),無(wú)論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達(dá)均促進(jìn)了巨噬細(xì)胞縱向遷移的能力,分別提高約30%(P<0.05)和40%(P<0.01);無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達(dá)均降低了巨噬細(xì)胞的縱向遷移能力,分別下降約50%(P<0.05)和80%(P<0.01)。通過(guò)吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),

10、無(wú)論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌微粒的能力沒(méi)有顯著影響;無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達(dá)均阻礙了巨噬細(xì)胞的吞噬能力,分別下降約40%和30%(P<0.05)。通過(guò)凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ADAM8的表達(dá)對(duì)于巨噬細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的過(guò)程無(wú)明顯影響。
　　2)調(diào)控ADAM8基因的表達(dá)影響了巨噬細(xì)胞的細(xì)胞剛度和流變性質(zhì),但不影響其收縮力。通過(guò)光學(xué)磁微粒扭轉(zhuǎn)細(xì)胞測(cè)量技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ADAM8表達(dá)的增高

11、對(duì)經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞剛度有提高作用,提高約40%(P<0.05),而對(duì)未經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞剛度沒(méi)有顯著影響;另外,無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞剛度均沒(méi)有顯著影響。另一方面,ADAM8表達(dá)的增高對(duì)經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架響應(yīng)外界刺激發(fā)生重塑的能力有提高作用,提高約20%(P<0.05),而對(duì)未經(jīng)LPS處理的巨噬細(xì)胞的流變性質(zhì)沒(méi)有顯著影響;無(wú)論給予或不給予LPS處理,抑制ADA

12、M8的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞的流變性質(zhì)沒(méi)有顯著影響。另外,無(wú)論給予或不給予LPS處理,ADAM8的表達(dá)對(duì)于巨噬細(xì)胞的收縮力沒(méi)有顯著影響。
　　3)ADAM8肽抑制劑BK-1361通過(guò)阻礙OVA致敏性哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的氣道炎癥有效緩解了其氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)等哮喘癥狀。通過(guò)全身體積描記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用降低了由乙酰膽堿誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道阻力(P<0.05),其中25μg/g和50μg/g小鼠體重

13、藥物濃度在50mg/mL乙酰膽堿濃度處可將氣道阻力降低約50%(P<0.05)。通過(guò)肺組織切片觀察發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用抑制了哮喘小鼠的氣道組織重構(gòu)的嚴(yán)重程度(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重藥物濃度可將氣道組織病理評(píng)分降低約50%(P<0.05)。通過(guò)肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用阻礙了哮喘小鼠氣道中炎癥細(xì)胞、特別是嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重藥物可

14、將炎癥細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)分別降低約50%和60%(P<0.05)。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用降低了哮喘小鼠肺組織中Th2細(xì)胞因子的基因表達(dá)(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重的藥物濃度對(duì)各種Th2細(xì)胞因子的整體控制效果較好。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用可將哮喘小鼠肺勻漿中ADAM8催化剪切CD23的產(chǎn)物sCD23的含量降低約40%至50%(P<0.05),但不影響ADAM8自激活

15、的產(chǎn)物sADAM8的含量;總體而言,25μg/g小鼠體重的藥物濃度對(duì)OVA致敏性小鼠哮喘的控制效果最好。
　　上述研究結(jié)果表明1)ADAM8可能通過(guò)提高巨噬細(xì)胞的遷移能力及其粘附于內(nèi)皮的能力,促進(jìn)哮喘氣道炎癥中巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞從血管系統(tǒng)到氣道組織的招募和遷移;2)ADAM8可能通過(guò)釋放相關(guān)炎癥因子和生長(zhǎng)因子,激活哮喘氣道炎癥中巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞的炎癥響應(yīng),從而加速哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展;3)ADAM8可能通過(guò)直接影響巨

16、噬細(xì)胞的力學(xué)特性從而在巨噬細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用;4)使用肽抑制劑BK-1361短暫抑制ADAM8在體內(nèi)的催化活性是一種相對(duì)安全的、效率較高的且具有較好療效的實(shí)驗(yàn)性哮喘治療新方法。
　　以上研究結(jié)果一方面對(duì)于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解ADAM8在哮喘氣道炎癥中的作用,特別是其表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞生理功能的影響及相關(guān)力學(xué)調(diào)控機(jī)制,并從細(xì)胞水平解釋不同研究結(jié)果中存在的矛盾具有重要的意義。另一方面本研究證實(shí)了ADAM8作為藥物靶點(diǎn)用于實(shí)驗(yàn)