供者骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠腎移植慢性排斥的作用及其免疫調(diào)節(jié)機制的初步研究.pdf

1、背景與目的：腎移植是治療終末期腎病患者的最有效手段,近年來隨著對移植免疫的進一步認識以及新型免疫抑制劑的問世,急性排斥反應(yīng)明顯下降,但是移植腎的長期存活率并沒有顯著改善,慢性排斥反應(yīng)已成為阻礙移植腎長期存活的主要原因。迄今為止,對慢性排斥反應(yīng)的防治主要集中于幾種免疫抑制劑,這些藥物都是非特異性的免疫抑制劑,治療效果不明顯,并且具有嚴重的副作用,尚無任何藥物及其他療法能真正有效地防治移植腎慢性排斥,臨床上迫切需要尋求防治移植腎慢性排斥的新

2、途徑。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)是骨髓中的非造血細胞集落,在不同的誘導(dǎo)條件下,可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、肌細胞、脂肪細胞等。既往研究表明,MSCs具有低免疫原性,能夠逃避免疫排斥,并且具有免疫抑制特性以及組織修復(fù)/再生作用,不少學(xué)者推測輸注MSCs有望誘導(dǎo)移植物包括移植腎的免疫耐受,達到移植物的長期存活。
　　 然而,盡管大量的體外試驗數(shù)據(jù)提示MSCs可能能夠抑制移植排斥反應(yīng),但是相關(guān)的體內(nèi)試驗研

3、究仍然比較缺乏,且結(jié)論不一。在某些研究中MSCs可促進受者對移植物的耐受,而某些研究則沒有影響甚至可引起或加重排斥。目前比較肯定的是MSCs在狒狒體內(nèi)可延長皮膚移植物的存活期；可治療骨髓移植后的移植物抗宿主病,已經(jīng)進入了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗,并且顯示了良好的臨床效果。在心臟移植方面,則有不同研究結(jié)論,有的研究發(fā)現(xiàn)可減輕排斥,有的發(fā)現(xiàn)甚至?xí)又嘏懦狻?dǎo)致這種不同研究結(jié)果的原因可能是MSCs在不同試驗條件下處于不同的免疫微環(huán)境以及輸注MSCs

4、的時間以及用量等的不同。MSCs還可以減輕胰島細胞移植的排斥反應(yīng)。目前多數(shù)研究認為MSCs需在一定條件下尤其是同時聯(lián)合使用短期的免疫抑制劑才有望誘導(dǎo)長期的移植物耐受。
　　 目前有關(guān)間充質(zhì)干細胞對腎移植的效應(yīng)的研究較少,部分研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞能夠減輕大鼠腎移植急性排斥反應(yīng),減少移植腎組織炎癥介質(zhì)如IL-1、TGF—β1等的表達,對大鼠早期移植腎具有保護作用。還有研究發(fā)現(xiàn)人腎移植供者來源的脂肪MSCs在體外能顯著抑制受體一供

5、者的混合淋巴細胞反應(yīng),顯著抑制腎移植受者移植前和移植后T細胞的增殖。但至今未見MSCs對于移植腎慢性排斥的遠期效果的影響的體內(nèi)研究,更未見其對腎移植慢性排斥的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用機制的研究。
　　 國際上公認的大鼠腎移植慢性排斥模型就是在短期使用小劑量的免疫抑制劑環(huán)孢素條件下形成的,該模型于移植后8—12周可出現(xiàn)典型的慢性排斥表現(xiàn),采用這個模型用于研究MSCs的作用符合加用免疫抑制劑的條件。因此,本研究采用這類模型作為研究對象,采用

6、文獻報道的具有體內(nèi)體外免疫抑制作用的細胞數(shù)量,同時根據(jù)文獻報道的MSCs的一般傳代規(guī)律,制定了干預(yù)時間點,觀察MSCs在同時短期使用環(huán)孢素A的條件下,對大鼠腎移植慢性排斥模型移植腎組織病理學(xué)和TGF—β1表達的影響及其不良反應(yīng)和副作用,判斷其確切治療效果；并通過檢測血清和腎組織Th1/Th2相關(guān)細胞因子的分泌水平,觀察其在大鼠腎移植慢性排斥模型的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用,探討其可能的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機制,為臨床應(yīng)用MSCs防治腎移植慢性排斥、誘導(dǎo)移

7、植腎長期存活提供進一步的體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1.SD-Wistar大鼠腎移植慢性排斥模型的建立和改進分別選用SD大鼠和Wistar大鼠作為供體和受體,采用顯微外科手術(shù)技術(shù)行SD—Wistar左腎原位腎移植術(shù)。麻醉后分離供體左腎動脈、靜脈、部分腹主動脈及輸尿管,切取供腎前用4℃乳酸林格氏液(含肝素25U/ml)通過腹主動脈原位灌注供腎至呈均勻土黃色。供腎置于4℃乳酸林格氏液無菌保存。在離斷受體左腎動脈、靜脈

8、及輸尿管后切除左腎,供、受體左腎動脈、腎靜脈及輸尿管分別行端端吻合。受體右腎不切除,完整保留作為每個移植腎樣本的內(nèi)對照。成活受體于手術(shù)當天及手術(shù)后9天,腹腔注射環(huán)孢素A微乳化劑2mg/kg,每日1次,以抑制急性排斥反應(yīng)。手術(shù)后當天一次性肌注氨芐青霉素鈉50mg/kg預(yù)防感染。術(shù)后4周、8周、第12周各取2只成活受體,處死后迅速摘取移植腎,用10％中性福爾馬林固定,制作石蠟切片,行HE、PAS和PASM-Masson’s染色,光鏡下動態(tài)觀

9、測組織病理學(xué)變化情況,按照Banff2007移植腎病理分類方案,判斷是否出現(xiàn)慢性排斥。隨機選取8只接受CsA短期治療的受體,于術(shù)后第4天從尾靜脈采血測定CsA濃度谷值。
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定采用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。取4周齡雄性SD大鼠處死,無菌條件下取其長骨,反復(fù)沖洗骨髓腔,收集細胞懸液。1000r/min,離心5min后,棄去上清。用含20％胎牛血清的L—DME

10、M培養(yǎng)基重懸細胞,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第三代,倒置顯微鏡下觀察MSCs形態(tài)；分別取P3代生長狀態(tài)良好的細胞,采用流式細胞術(shù)檢測其細胞周期:取生長良好的第三代細胞,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測其CD29,CD34,D44,CD45陽性率,同時用小鼠IgG1-FITC和IgG1-PE作為同型抗體對照；同時做骨髓間充質(zhì)干細胞成脂肪細胞誘導(dǎo)分化以進一步鑒定MSCs。取P3代生長狀態(tài)良好的細胞,用誘導(dǎo)脂肪樣細

11、胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng),2周后行油紅0染色觀察有否出現(xiàn)脂肪滴。
　　 3.供者骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠腎移植慢性排斥移植腎組織病理學(xué)的影響SD雄性大鼠作為供者,Wistar雌性大鼠作為受體,行SD—Wistar大鼠左腎原位移植。保留受體自身右腎作為每一個移植腎的內(nèi)對照。所有受體均于術(shù)后當天一次性肌肉注射氨芐青霉素50mg/kg體重預(yù)防感染。取腎移植手術(shù)成功存活受體23只進入實驗分組。23只成功移植的受體分成MSCs+環(huán)孢素A治療組(簡

12、稱治療組,n=8)、環(huán)孢素A對照組(簡稱對照組,n=8)及單純移植組(n=7)。治療組和對照組所有受體均從術(shù)后當天起給予10天的小劑量環(huán)孢素A(2mg/kg.d,腹腔注射)治療,以抑制急性排斥反應(yīng)。治療組(n=8)每只受體除給予小劑量環(huán)孢素A治療外,另取SD大鼠來源骨髓MSCs,制備成1×107個/ml細胞懸液,于手術(shù)當天關(guān)腹前從左髂靜脈注入1×107個/kg體重MSCs,于術(shù)后第3天和第7天從尾靜脈再次注入同樣劑量的MSCs。MSCs

13、輸注后每日觀察治療組受者可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。對照組(n=7)則注入相同容量的生理鹽水。單純移植組未接受MSCs以及環(huán)孢素A免疫抑制治療。移植后第4周即陸續(xù)獲取單純移植組雙腎行大體觀察及組織病理學(xué)檢測。移植后12周,治療組和對照組受體大鼠處死后,迅速摘取移植腎和受體自身右腎,分別行HE染色、PAS染色和PASM—Masson染色。參照Banff1997以及Banff2007移植腎病理分類方案制定評分標準,由兩位觀察者光鏡下雙盲方式觀測對比

14、組織病理學(xué)變化情況,分別對移植腎組織的腎間質(zhì)炎(i,單個核細胞浸潤)、間質(zhì)纖維化(ci)、腎小管萎縮(ct)、移植腎腎小球病(cg)、動脈內(nèi)膜纖維性增厚(cv)等慢性損害進行評分,每項分為0～3分,總分0～15分。另外計算每張切片硬化的腎小球占所有腎小球的百分比。同時對治療組和對照組所有受者作大體解剖以了解MSCs有無誘發(fā)腫瘤。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達留取治療組和對照組術(shù)后12周移

15、植腎和受體自身右腎部分腎組織作免疫組織化學(xué)染色檢測TGF—β1的表達。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清和移植腎組織細胞因子濃度水平移植后12周,采集治療組和對照組受體以及8只健康Wistar大鼠血清和腎組織行ELISA檢測IFN—γ、TNF-α、IL-4、IL-10濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1.整個實驗過程共65對大鼠施行腎移植手術(shù),預(yù)實驗階段37對和正式實驗28對,預(yù)實驗階段存活受體20只,其

16、中移植腎存活12只,成功率只有32％；正式實驗成活受體24只,其中移植腎存活23只,成功率82％。正式實驗階段熱缺血時間10S～15S,冷缺血時間40min～60min,總手術(shù)時間2h～2.5h,其中受體腎移植手術(shù)時間1.5～2h。術(shù)后第12周,移植腎仍存活,體積較右腎縮小,色澤較蒼白,光鏡下呈典型的慢性排斥病理改變,尤以小動脈內(nèi)膜纖維樣增厚為其特征性組織學(xué)改變。陰性內(nèi)對照的右腎未出現(xiàn)任何組織學(xué)改變。術(shù)后第4天環(huán)孢素A濃度谷值是153.

17、2±17.1ng/ml。
　　 2.MSCs原代細胞傳代培養(yǎng)至第三代,光鏡下見細胞呈梭形、星形,成纖維樣,細胞形態(tài)較均一。使用流式細胞儀對P3代MSCs進行細胞周期檢測,結(jié)果顯示MSCs中G0/G1期的細胞約占81.5％以上。利用FCM檢測培養(yǎng)的P3代骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD29陽性細胞的比例達到98.3％；CD44陽性細胞達到99.2％；CD34和CD45陰性細胞的比例分別為98.9％、96.6％。P3代

18、骨髓MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后見大量脂肪滴相互融合,細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形,油紅0染色顯示有大量紅色脂滴沉淀,證實為脂肪細胞。
　　 3.單純移植組在4周內(nèi)所有受體移植腎明顯腫脹增大,暗淡,移植腎壞死。治療組輸注MSCs后無1例次出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸困難等不良反應(yīng),無發(fā)現(xiàn)術(shù)口感染以及其他感染情況。術(shù)后12周,兩組各組織器官均未見腫瘤發(fā)生；治療組和對照組兩組大鼠納入統(tǒng)計的受體移植腎均存活,體積較正常右腎略小,色澤較蒼白,出現(xiàn)不同程度

19、的慢性排斥組織病理學(xué)改變。治療組大鼠移植腎組織的各種組織病理學(xué)損害(5.13±0.99)均較對照組(10.13±0.99)減輕(P=0.000),腎小球硬化率(％,12.44±1.01)低于對照組(％,27.21±3.23)(P=0.000)。
　　 4.治療組和對照組移植腎腎小管上皮細胞、間質(zhì)細胞及腎小球的TGF—β1表達均可呈陽性,并且染色強度較強。治療組移植腎組織的TGF—β1表達低于對照組(P=0.043)。
　　

20、 5.治療組血清IL-4濃度(pg/ml,48.18±5.43)較對照組(36.67±9.93)高(P=0.008),兩組血清IL-10、IFN—γ濃度差異無顯著性意義(P=0.105,P=0.455),治療組血清TNF-α水平(pg/mL)(15.53±9.63)低于對照組(48.81±19.17)(P=0.000)。治療組血清Th1/Th2(IFN—γ/IL-4)(1.52±0.63)低于對照組(2.47±0.99)(t=2.26

21、9,P=0.040)。治療組和對照組移植腎組織上清液IL-4、IL-10、IFN—γ、TNF-α濃度均高于正常組(均有P=0.000)。治療組移植腎IL-4濃度(311.54±53.45)高于對照組(210.82±56.01)(P=0.000),IL-10、IFN—γ以及TNF—α濃度與對照組相比差異無顯著性意義(P=0.254,P=0.349,P=0.480),Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)(1.41±0.42)低于對照組(2

22、.40±0.83)(P=0.009)。
　　 結(jié)論：
　　 1.給予保留受體自身右腎的SD->Wistar大鼠腎移植受體腹腔注射10天小劑量的環(huán)孢素A微乳化制劑(2mg/kg.d),可誘導(dǎo)移植腎長期存活并于12周內(nèi)可形成慢性排斥的典型組織病理學(xué)改變,可作為研究腎移植慢性排斥的動物模型；
　　 2.采用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法可獲取純度較高的骨髓MSCs。本實驗培養(yǎng)的細胞經(jīng)形態(tài)學(xué)、細胞表型特點及其可誘導(dǎo)成脂肪細胞分化鑒

23、定證實為骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 3.供者骨髓MSCs可明顯改善大鼠移植腎慢性排斥組織病理學(xué)損害,對大鼠移植腎具有遠期的保護作用。本研究所采用的細胞劑量及用法還不足以誘導(dǎo)移植物完全免疫耐受；該劑量的MSCs輸注未發(fā)現(xiàn)致腫瘤及感染等副作用,安全性好。
　　 4.供者骨髓間充質(zhì)干細胞在移植腎慢性排斥受體體內(nèi)能下調(diào)移植腎組織TGF—β1的表達；移植腎組織TGF—β1表達的下調(diào)可能是MSCs通過其他免疫抑制途徑以及其他機制對慢性