豬中性粒細胞磷酸二酯酶表達及活性與中藥抗炎作用的研究.pdf

1、第二信使cAMP、CGMP在各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細胞代謝中均發(fā)揮著主導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。磷酸二酯酶P(DE)是cAMP/PKA和cGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，對調(diào)節(jié)細胞cAMP、cGMP含量具有決定性作用。中性粒細胞是最重要的炎癥細胞，其功能與cAMP水平密切相關(guān)，且胞內(nèi)PDE同功酶中以特異性水解cAMP的PDE4占主導(dǎo)優(yōu)勢，而以中性粒細胞PDE變化來研究中藥的抗炎作用則未見報道。因此，以中性粒細胞PDE為靶點來篩選特異性中藥抑制

2、劑，對中性粒細胞活性進行調(diào)節(jié)，控制其活化和繼發(fā)的炎癥，則對各種炎癥性疾病的治療具有普遍意義。該項研究不僅能揭示炎癥過程中性粒細胞功能與PDE表達及活性的變化規(guī)律，而且能從分子水平豐富中藥的抗炎機制。研究內(nèi)容如下： 以RT-PCR檢測PDE表達，以HPIC測定PDE活性。結(jié)果表明：檢測的18個PDE亞型中，在豬中性粒細胞表達的有PDElB、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A共15個

3、亞型，特異性抑制劑實驗表明PDE4、PDE5分別為水解cAMP、cGMP的兩個主要存在的型；豬中性粒細胞內(nèi)存在高活性的PDE，PDE量在一定范圍內(nèi)，與其活性存在良好的線性關(guān)系。因此，以豬中性粒細胞為樣本提取PDE可作為篩選PDE中藥抑制劑的方法。 實驗選取了祛邪、扶正等共79味中藥。通過PDE活性抑制實驗，篩選出自芍等多昧高效抑制中藥，同時也發(fā)現(xiàn)某些中藥如薏苡仁等對PDE活性具有顯著促進作用。考察了高效抑制中藥白芍、黃連和金銀花

4、主要有效成分芍藥苷、小檗堿及綠原酸對PDE活性的影響，結(jié)果表明其抑制率均較低。因此，鑒于中藥藥效的整體性及成分的復(fù)雜性，挑選白芍等4昧中藥精制成注射液，PDE抑制實驗表明僅有白芍對其抑制率最高。因此，選出白芍注射液作為‘PDE抑制劑研究其抗炎作用及對。PDE表達和活性的影響。 以細胞色素C還原法檢測呼吸爆發(fā)，半定量RT-PCR測定PDE表達。結(jié)果表明白芍注射液呈劑量依賴性抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)，且對其彈性蛋白酶釋放具有雙重調(diào)節(jié)作

5、用，即低濃度抑制、高濃度促進作用。自芍注射液對培養(yǎng)中性粒細胞PDE活性具有明顯抑制作用，且能在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制其主要存在的PDE4B的表達。以上結(jié)果提示白芍注射液對PDE表達、活性的抑制和對中性粒細胞功能的影響存在一定的相關(guān)性，也表明白芍注射液體外具有較好的抗炎作用。 進一步的動物實驗表明白芍注射液對小鼠耳腫脹模型耳腫脹度具有顯著的抑制作用，對小鼠胸膜炎模型血漿MDA含量具有明顯降低作用，顯示了較好的抗炎性。HPIC指紋圖譜分析