毛冬青相關有效成分篩選及其抑制磷酸二酯酶活性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  磷酸二酯酶(PDEs)具有水解細胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)或環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的功能,從而終結這些第二信使所傳導的生化作用。11種PDE酶家族中的7種PDE酶,已被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中表達,提示PDE酶在心血管系統(tǒng)病生理過程中的重要作用。近年來,PDE酶作為新的心血管疾病治療靶點,成為一個新的研究熱點。毛冬青作為一個常用中藥,具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等功效,在冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病治療方面應用廣泛

2、。課題組在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)毛冬青對心血管疾病特別是心衰方面有著良好的藥理作用,也有文獻表明毛冬青甲素具有PDE酶的抑制活性,然而毛冬青藥材的作用基礎和可能的靶點等尚未有較系統(tǒng)的揭露。
  本文旨在建立一種聯(lián)合應用超濾技術和液質聯(lián)用技術的快速篩選方法,對毛冬青中潛在的PDE酶抑制成分進行研究,探討毛冬青對心血管疾病藥理作用的可能機制。
  方法:
  1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
  毛冬青根粉碎

3、至80目,以80%甲醇超聲提取,提取物溶液在高效液相色譜儀中,以乙腈-0.1%甲酸水的流動相體系進行梯度洗脫分離,二極管陣列檢測器檢測后,在線聯(lián)用電噴霧離子-離子阱-飛行時間質譜儀進行分析,將所得的色譜和質譜行為數(shù)據(jù)與文獻對照,并對相應的多級質譜碎片進行質譜裂解分析,得到初步的化合物結構解析結果,部分化合物進一步與標準品的色譜保留時間和質譜行為數(shù)據(jù)進行對照,驗證結構鑒定結果。
  2.毛冬青根中4種綠原酸類和4中皂苷類成分的含量測

4、定
  毛冬青根粉碎至80目,以80%甲醇超聲提取,提取物定容為0.05 g·mL-1(以生藥計)的供試品溶液。精密稱取各對照品,分別加入甲醇配制成含如下濃度的對照品溶液,綠原酸12.5μg·mL-1,異綠原酸B29.6μg·mL-1,異綠原酸A30.0μg·mL-1,異綠原酸C34.5μg·mL-1,毛冬青皂苷B1169.5μg·mL-1,毛冬青皂苷B2130.5μg·mL-1,毛冬青皂苷A1324.0μ g·mL-1,冬青素A

5、728.0μg·mL-1,按比例稀釋,繪制各化合物的標準曲線。對照品和供試品在相同的色譜條件下進行測定,以混合對照品溶液進行方法學考察,包括精密度、定量限、檢測限等,并對樣品的穩(wěn)定性進行考察,最后測定得到各化合物成分在毛冬青根中的含量。
  3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結合成分的LC-MS分析
  制備濃度為0.1 g·mL-1(以生藥計)的毛冬青根提取物溶液,與20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進行孵育,置于容量4 mL截留

6、分子量為10 kDa的超濾管中進行分離,分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復合物以50%甲醇洗脫,收集并以氮氣吹干,定容后進行高效液相-二極管陣列檢測器-電噴霧離子-離子阱-飛行時間質譜儀聯(lián)用進行分析,將所得的的色譜和質譜行為數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物的數(shù)據(jù)進行對照,并對相應的多級質譜碎片進行質譜裂解分析,得到初步的化合物結構解析結果,部分化合物進一步與標準品的色譜保留時間和質譜行為數(shù)據(jù)進行對照,驗證結構鑒定結果。
  4.毛冬青根中主要成分與

7、PDEⅠ酶結合的活性研究
  制備濃度為0.1 g·mL-1(以生藥計)的毛冬青根提取物溶液,分別與濃度為0,10 U·mL-1,20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進行孵育,后置于容量4mL截留分子量為10kDa的超濾管中進行分離,分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復合物以50%甲醇洗脫,收集并以氮氣吹干,定容到200μL進行分析。同時,精密稱取各對照品,分別加入甲醇配制成含如下濃度的對照品溶液,異綠原酸B10.24μ g·mL-1,異綠

8、原酸A8.96μg·mL-1,異綠原酸C7.84μg·mL-1,毛冬青皂苷B168.8μg·mL-1,毛冬青皂苷B253.6μg·mL-1,毛冬青皂苷A167.2μ g·mL-1,冬青素A475.2μ g·mL-1,按比例稀釋,繪制各化合物的標準曲線,并計算得到各化合物在供試品中的濃度。按照色譜峰增強因子的計算公式,計算各有效成分在不同濃度PDEⅠ酶溶液中的富集程度,研究相應的結合活性。
  5.毛冬青根中活性成分對PDEⅠ酶的半

9、數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
  毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下與PDEⅠ酶混合孵育,用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對PDEⅠ酶的活性進行檢測,使用多功能酶標儀于620 nm處測定OD值,然后根據(jù)標準曲線求出對應的5'-AMP釋出量,與空白對照組相比,求得相應濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對1g[藥物濃度]作圖,用GraphPad Prism5軟件進行非線性擬合,求得相應藥物的IC50。
  6.毛冬青根中活性成分

10、對PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
  毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下分別與PDE5A、PDE9A酶混合孵育,用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對PDE5A、PDE9A酶的活性進行檢測,使用多功能酶標儀于620 nm處測定OD值,然后根據(jù)相應的標準曲線求出對應的5'-GMP釋出量,與空白對照組相比,求得相應濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對1g[藥物濃度]作圖,用GraphPad Prism5軟件進行非

11、線性擬合,求得相應藥物的IC50。
  結果:
  1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
  在對毛冬青根提取的條件進行優(yōu)化的基礎上,建立了分析毛冬青根中主要成分的HPLC色譜條件;在文獻總結、質譜條件優(yōu)化的基礎上,建立了液質聯(lián)用分析毛冬青根中主要成分的質譜條件。通過對毛冬青根的甲醇提取物進行的分析,分離鑒定出11個化合物,分別為綠原酸、tortosideA、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3,4,5-三咖

12、啡??鼘幩帷⒚嘣碥誃3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
  2.毛冬青藥材中4種綠原酸類及4種皂苷的含量測定
  建立了HPLC法同時測定毛冬青根中8個成分含量。綠原酸,異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C,毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1,冬青素A的質量濃度分別在1.25~12.5、2.96~29.6、3~30、3.45~34.5、13.05~130.5、32.4~324、16.

13、95~169.5、72.8~728μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系,平均加樣回收率(n=9)均高于95%,RSD值均小于3.0%。3批樣品測定結果分別為:0.13~0.15、0.23~0.27、0.31~0.37、0.27~0.28、1.24~1.65、2.42~2.86、2.18~2.81、8.29~10.44mg·g-1。方法學驗證及3批樣品的測定結果表明,該方法簡便、準確,適用于同時測定毛冬青根中8個成分的含量測定。<

14、br>  3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結合成分的LC-MS分析
  應用超濾技術,對毛冬青根提取物中具有與PDEⅠ酶結合活性的主要成分進行富集、分離,并應用HPLC-DAD-IT-TOF-MS聯(lián)用技術對相關成分進行分析,將所得的化合物的色譜行為和質譜數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物中的數(shù)據(jù)進行比較分析,鑒定出11個具有PDEⅠ酶結合活性的化合物成分,分別為綠原酸、tortoside A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3,4,5-三咖啡酰奎

15、寧酸、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
  4.毛冬青根中主要成分與PDEⅠ酶結合的活性研究
  應用色譜峰增強因子,對其中7個主要活性成分與PDEⅠ酶結合活性進行分析,初步篩選出可能具有PDEⅠ酶抑制活性的化合物,按照結合活性大小,依次為異綠原酸A>毛冬青皂苷B2>異綠原酸C>冬青素A>異綠原酸B>毛冬青皂苷B1>毛冬青皂苷A1。
  5.毛冬青根中活性成分對PDEⅠ酶的半數(shù)

16、抑制濃度(IC50)的測定
  異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對PDEⅠ酶抑制活性(IC50)分別為779.5μM,1516μM,>106μM,44.79μM,459.5μM,313.1μ M,158μM,250μM。
  6.毛冬青根中活性成分對PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
  異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地

17、那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對PDE5A酶抑制活性(IC50)分別為193.5μ M,436.8μM,>104μM,0.43μM,1801.7μM,48.8μM,22.4μM,176.6μM;對PDE9A酶抑制活性(IC50)分別為>104μM,213.7μM,1452μM,2568μM,3944μM,8810μM,>105μM,4546μM。
  結論:
  首次建立了一種聯(lián)合應用超濾技術

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