毛冬青相關有效成分篩選及其抑制磷酸二酯酶活性的研究.pdf

1、目的:
　　磷酸二酯酶(PDEs)具有水解細胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）或環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的功能，從而終結這些第二信使所傳導的生化作用。11種PDE酶家族中的7種PDE酶，已被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中表達，提示PDE酶在心血管系統(tǒng)病生理過程中的重要作用。近年來，PDE酶作為新的心血管疾病治療靶點，成為一個新的研究熱點。毛冬青作為一個常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等功效，在冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病治療方面應用廣泛

2、。課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)毛冬青對心血管疾病特別是心衰方面有著良好的藥理作用，也有文獻表明毛冬青甲素具有PDE酶的抑制活性，然而毛冬青藥材的作用基礎和可能的靶點等尚未有較系統(tǒng)的揭露。
　　本文旨在建立一種聯(lián)合應用超濾技術和液質聯(lián)用技術的快速篩選方法，對毛冬青中潛在的PDE酶抑制成分進行研究，探討毛冬青對心血管疾病藥理作用的可能機制。
　　方法:
　　1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
　　毛冬青根粉碎

3、至80目，以80％甲醇超聲提取，提取物溶液在高效液相色譜儀中，以乙腈-0.1％甲酸水的流動相體系進行梯度洗脫分離，二極管陣列檢測器檢測后，在線聯(lián)用電噴霧離子-離子阱-飛行時間質譜儀進行分析，將所得的色譜和質譜行為數(shù)據(jù)與文獻對照，并對相應的多級質譜碎片進行質譜裂解分析，得到初步的化合物結構解析結果，部分化合物進一步與標準品的色譜保留時間和質譜行為數(shù)據(jù)進行對照，驗證結構鑒定結果。
　　2.毛冬青根中4種綠原酸類和4中皂苷類成分的含量測

4、定
　　毛冬青根粉碎至80目，以80％甲醇超聲提取，提取物定容為0.05 g·mL-1（以生藥計）的供試品溶液。精密稱取各對照品，分別加入甲醇配制成含如下濃度的對照品溶液，綠原酸12.5μg·mL-1，異綠原酸B29.6μg·mL-1，異綠原酸A30.0μg·mL-1，異綠原酸C34.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B1169.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B2130.5μg·mL-1，毛冬青皂苷A1324.0μ g·mL-1，冬青素A

5、728.0μg·mL-1，按比例稀釋，繪制各化合物的標準曲線。對照品和供試品在相同的色譜條件下進行測定，以混合對照品溶液進行方法學考察，包括精密度、定量限、檢測限等，并對樣品的穩(wěn)定性進行考察，最后測定得到各化合物成分在毛冬青根中的含量。
　　3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結合成分的LC-MS分析
　　制備濃度為0.1 g·mL-1（以生藥計）的毛冬青根提取物溶液，與20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進行孵育，置于容量4 mL截留

6、分子量為10 kDa的超濾管中進行分離，分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復合物以50％甲醇洗脫，收集并以氮氣吹干，定容后進行高效液相-二極管陣列檢測器-電噴霧離子-離子阱-飛行時間質譜儀聯(lián)用進行分析，將所得的的色譜和質譜行為數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物的數(shù)據(jù)進行對照，并對相應的多級質譜碎片進行質譜裂解分析，得到初步的化合物結構解析結果，部分化合物進一步與標準品的色譜保留時間和質譜行為數(shù)據(jù)進行對照，驗證結構鑒定結果。
　　4.毛冬青根中主要成分與

7、PDEⅠ酶結合的活性研究
　　制備濃度為0.1 g·mL-1（以生藥計）的毛冬青根提取物溶液，分別與濃度為0，10 U·mL-1，20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進行孵育，后置于容量4mL截留分子量為10kDa的超濾管中進行分離，分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復合物以50％甲醇洗脫，收集并以氮氣吹干，定容到200μL進行分析。同時，精密稱取各對照品，分別加入甲醇配制成含如下濃度的對照品溶液，異綠原酸B10.24μ g·mL-1，異綠

8、原酸A8.96μg·mL-1，異綠原酸C7.84μg·mL-1，毛冬青皂苷B168.8μg·mL-1，毛冬青皂苷B253.6μg·mL-1，毛冬青皂苷A167.2μ g·mL-1，冬青素A475.2μ g·mL-1，按比例稀釋，繪制各化合物的標準曲線，并計算得到各化合物在供試品中的濃度。按照色譜峰增強因子的計算公式，計算各有效成分在不同濃度PDEⅠ酶溶液中的富集程度，研究相應的結合活性。
　　5.毛冬青根中活性成分對PDEⅠ酶的半

9、數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
　　毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下與PDEⅠ酶混合孵育，用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對PDEⅠ酶的活性進行檢測，使用多功能酶標儀于620 nm處測定OD值，然后根據(jù)標準曲線求出對應的5'-AMP釋出量，與空白對照組相比，求得相應濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對1g[藥物濃度]作圖，用GraphPad Prism5軟件進行非線性擬合，求得相應藥物的IC50。
　　6.毛冬青根中活性成分

10、對PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
　　毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下分別與PDE5A、PDE9A酶混合孵育，用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對PDE5A、PDE9A酶的活性進行檢測，使用多功能酶標儀于620 nm處測定OD值，然后根據(jù)相應的標準曲線求出對應的5'-GMP釋出量，與空白對照組相比，求得相應濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對1g[藥物濃度]作圖，用GraphPad Prism5軟件進行非

11、線性擬合，求得相應藥物的IC50。
　　結果:
　　1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
　　在對毛冬青根提取的條件進行優(yōu)化的基礎上，建立了分析毛冬青根中主要成分的HPLC色譜條件;在文獻總結、質譜條件優(yōu)化的基礎上，建立了液質聯(lián)用分析毛冬青根中主要成分的質譜條件。通過對毛冬青根的甲醇提取物進行的分析，分離鑒定出11個化合物，分別為綠原酸、tortosideA、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3，4，5-三咖

12、啡?？鼘幩帷⒚嘣碥誃3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
　　2.毛冬青藥材中4種綠原酸類及4種皂苷的含量測定
　　建立了HPLC法同時測定毛冬青根中8個成分含量。綠原酸，異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1，冬青素A的質量濃度分別在1.25～12.5、2.96～29.6、3～30、3.45～34.5、13.05～130.5、32.4～324、16.

13、95～169.5、72.8～728μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率（n=9）均高于95％，RSD值均小于3.0％。3批樣品測定結果分別為:0.13～0.15、0.23～0.27、0.31～0.37、0.27～0.28、1.24～1.65、2.42～2.86、2.18～2.81、8.29～10.44mg·g-1。方法學驗證及3批樣品的測定結果表明，該方法簡便、準確，適用于同時測定毛冬青根中8個成分的含量測定。<

14、br>　　3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結合成分的LC-MS分析
　　應用超濾技術，對毛冬青根提取物中具有與PDEⅠ酶結合活性的主要成分進行富集、分離，并應用HPLC-DAD-IT-TOF-MS聯(lián)用技術對相關成分進行分析，將所得的化合物的色譜行為和質譜數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物中的數(shù)據(jù)進行比較分析，鑒定出11個具有PDEⅠ酶結合活性的化合物成分，分別為綠原酸、tortoside A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3，4，5-三咖啡酰奎

15、寧酸、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
　　4.毛冬青根中主要成分與PDEⅠ酶結合的活性研究
　　應用色譜峰增強因子，對其中7個主要活性成分與PDEⅠ酶結合活性進行分析，初步篩選出可能具有PDEⅠ酶抑制活性的化合物，按照結合活性大小，依次為異綠原酸A＞毛冬青皂苷B2＞異綠原酸C＞冬青素A＞異綠原酸B＞毛冬青皂苷B1＞毛冬青皂苷A1。
　　5.毛冬青根中活性成分對PDEⅠ酶的半數(shù)

16、抑制濃度(IC50)的測定
　　異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對PDEⅠ酶抑制活性(IC50)分別為779.5μM，1516μM,＞106μM,44.79μM,459.5μM,313.1μ M,158μM,250μM。
　　6.毛冬青根中活性成分對PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
　　異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地

17、那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對PDE5A酶抑制活性(IC50)分別為193.5μ M，436.8μM,＞104μM,0.43μM,1801.7μM,48.8μM,22.4μM,176.6μM;對PDE9A酶抑制活性(IC50)分別為＞104μM，213.7μM，1452μM，2568μM，3944μM，8810μM,＞105μM,4546μM。
　　結論:
　　首次建立了一種聯(lián)合應用超濾技術