人源磷酸二酯酶6(PDE6)γ亞基蛋白的克隆、表達以及純化.pdf

1、環(huán)鳥苷酸和環(huán)腺苷酸是細胞內(nèi)重要的第二信使且在信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)換過程中都有著非常重要的調(diào)節(jié)功能。磷酸二酯酶（PDE）是環(huán)核苷酸信號轉(zhuǎn)導過程中的決定性環(huán)節(jié)而且對調(diào)節(jié)其細胞內(nèi)水平具有關(guān)鍵性作用。 磷酸二酯酶6（PDE6）是以環(huán)鳥苷酸為特異性底物的磷酸二酯酶，在光感受器細胞的生化級聯(lián)反應(yīng)過程中起了重要的作用，根據(jù)其存在的形式不同可分為視網(wǎng)膜桿狀細胞PDE6（Rod-PDE6）及視網(wǎng)膜錐狀細胞PDE6（Cone-PDE6），其中以視網(wǎng)膜桿狀

2、細胞為主。Rod-PDE6全酶是一個四聚體復合物，包括兩個大的催化亞基（α和β）和兩個小的抑制亞基（γ），其中γ亞基主要是通過結(jié)合α和β催化亞基的催化位點從而抑制全酶活性。為了研究人源rod-PDE6γ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能從而了解其在視覺信號傳導過程中的作用，我們研究了該目的蛋白的重組表達和分離純化的方法。 本文利用PCR技術(shù)體外擴增了PDE6γ的編碼基因，并通過NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點將其與表達載體pET-22b連接，從

3、而構(gòu)建了其重組表達質(zhì)粒pET22b-PDE6γ，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，得到該蛋白的重組表達工程菌。分別采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、尿素變性凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等方法對影響重組蛋白表達及純化的因素進行了研究，并對誘導表達溫度進行了優(yōu)化，確定該蛋白的最佳表達溫度為16℃。通過金屬離子螯合親和層析柱對該蛋白進