三氧化二砷誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡及影響其侵襲性和粘附性的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討svk在人乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)變化，研究AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡、對乳腺癌細(xì)胞侵襲性和粘附性影響與svk表達(dá)的相關(guān)性。 方法： 1 用RT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測MDA-MB-468和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞株Svk、MMP-9和ICAM-1的表達(dá)。 2 采用MTT法分析As203對MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作

2、用。 3 用不同濃度AS<,2>O<,3>分別處理MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞后，采用Gimsa染色技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；用半定量RT-PCR法、流式細(xì)胞技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平研究AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡前后細(xì)胞Svk、MMP-9和ICAM-1表達(dá)的變化，分析AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及影響其侵襲性和粘附性的可能機(jī)制。 4 AS<,2>O<,3>體內(nèi)抑瘤作用的實(shí)

3、驗(yàn)研究采用右腋皮下接種法，分別接種MDA-MB-468(syk<'+>)和MDA-MB-231(syk<'->)細(xì)胞建立荷瘤裸鼠動物模型，通過尾靜脈注射AS<,2>O<,3>，連續(xù)注射七天，觀察AS<,2>O<,3>對荷瘤小鼠腫瘤形成以及小鼠生存期的影響。 5 收集各組裸鼠的腫瘤組織，用4％多聚甲醛固定后，進(jìn)行免疫組化、HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。 6 用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組裸鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡情況及Syk、

4、MMP-9和ICAM-1蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果： 1 MDA-MB-468細(xì)胞Syk表達(dá)陽性，而MDA-MB-231細(xì)胞Syk表達(dá)陰性。MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞均表達(dá)MMP-9和ICAM-1，但MMP-9在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)水平強(qiáng)于MDA-MB-468細(xì)胞；而ICAM-1在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平弱于MDA-MB-468細(xì)胞。 2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AS<,2>O<,

5、3>可顯著抑制MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，且抑制效應(yīng)與AS<,2>O<,3>呈劑量和作用時間依賴性(P<0.01)。其中AS<,2>O<,3>對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于對MDA-MB-468細(xì)胞的抑制作用。 3 AS<,2>O<,3>作用于MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞后，可誘導(dǎo)較典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核向外呈銳角突起，染色質(zhì)高度濃縮，電子密

6、度增高，邊集于核膜下或呈新月形，有的出現(xiàn)核固縮，核碎裂等；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，4μg/ml AS<,2>O<,3>處理48h，誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞的凋亡率可達(dá)5.80％，而未處理組細(xì)胞凋亡率只有2.03％；誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率可達(dá)9.32％，未處理組細(xì)胞凋亡率只有1.41％；在AS<,2>O<,3>作用下，MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞周期也發(fā)生了改變，G<,2>/M期和S期細(xì)胞明顯增多，G<,0>

7、/G，期細(xì)胞比率顯著下降，細(xì)胞周期被阻滯在S+G<,2>/M期。 4 不同濃度的AS<,2>O<,3>處理MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞前后，RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的MMP-9基因表達(dá)受抑，而ICAM-1基因的表達(dá)上調(diào)。MDA-MB-231細(xì)胞Svk基因表達(dá)仍陰性，但MDA-MB-468細(xì)胞Svk基因表達(dá)上調(diào)。 5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AS<,2>O<,3>具有明顯的抑瘤作用，

8、流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，用AS<,2>O<,3>治療后腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生了凋亡現(xiàn)象，用藥后接種MDA-MB-231(syk<'->)細(xì)胞，荷瘤裸鼠的腫瘤組織細(xì)胞凋亡率達(dá)49.04‰而其對照組的凋亡率是9.41％；接種MDA-MB-468(syk<'+>)細(xì)胞荷瘤裸鼠的腫瘤組織中，細(xì)胞的凋亡率為37.85％，其對照組的凋亡率是12.34％。 6 免疫組化及流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)AS<,2>O<,3>治療的荷瘤裸鼠組織中，ICA

9、M-1標(biāo)記指數(shù)比陰性對照組高，且接種MDA-MB-468(syk<'+>)細(xì)胞荷瘤裸鼠的腫瘤組織，ICAM-1的表達(dá)水平高于接種MDA-MB-231(syk<'->)細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織；經(jīng)AS<,2>O<,3>治療的荷瘤裸鼠組織MMP-9標(biāo)記指數(shù)比陰性對照組低，接種MDA-MB-468(syk<'+>)細(xì)胞荷瘤裸鼠的腫瘤組織MMP-9的表達(dá)低于接種MDA-MB-231(syk<'->)細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織，且差異均有顯著性。Svk在瘤組織

10、中表達(dá)陰性。 結(jié)論： 1 AS<,2>O<,3>體外和體內(nèi)均具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。 2 Svk在惡性程度低的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468中表達(dá)陽性，在惡性程度高的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中表達(dá)陰性。 3 AS<,2>O<,3>可降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲性、增加其粘附性，經(jīng)AS<,2>O<,3>作用后，乳腺癌細(xì)胞的Syk表達(dá)增加。提示AS<,2>O<,3>誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及影響其侵襲性和粘附