尿毒清顆粒對慢性腎功能衰竭藥理作用的分子機(jī)制.pdf

1、慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)見于各種慢性腎臟疾病的晚期,為各種原發(fā)和繼發(fā)性慢性腎臟疾病持續(xù)發(fā)展的共同轉(zhuǎn)歸。發(fā)病率大約萬分之一,死亡率高達(dá)67.6％,占人群死亡率的10％,只有20％的患者在排除可逆因素后獲得緩解。當(dāng)患者進(jìn)入慢性腎功能衰竭終末期(尿毒癥)階段后,治療棘手,全身各系統(tǒng)都會受損,嚴(yán)重危害人類的健康和生命。西藥治療常采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEIs)和血管緊張素受體拮抗劑(ARBs)

2、,但這兩種藥物只能達(dá)到緩解慢性腎功能衰竭的作用,而無法阻斷慢性腎功能衰竭的進(jìn)程；隨著技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了透析和移植兩個腎臟替代治療方式,但是價格昂貴,供腎不足等因素又限制了其應(yīng)用。因此,探求中醫(yī)療法是一條重要途徑。尿毒清顆粒(UremicClearance Granule)主要用于慢性腎功能衰竭氮質(zhì)血癥期和尿毒癥早期、中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁癥和脾虛血瘀癥者的治療,已有十余年的臨床應(yīng)用歷史,但大多數(shù)研究屬于臨床療效觀察,對于作用機(jī)理方面的研究較少

3、,動物實(shí)驗(yàn)研究尚缺乏深度,為了使其得到廣泛的推廣應(yīng)用,利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段與多學(xué)科方法研究該方的有效成分和作用機(jī)理就成了當(dāng)務(wù)之急。
　　 本文以腺嘌呤飼喂法建立的慢性腎功能衰竭Wistar大鼠模型為實(shí)驗(yàn)材料,采用分子生物學(xué)的方法從DNA甲基化修飾、關(guān)鍵基因的mRNA及蛋白表達(dá),以及疾病相關(guān)代謝產(chǎn)物三個層次系統(tǒng)地研究了尿毒清顆粒對慢性。腎功能衰竭治療的分子機(jī)制,研究結(jié)果為尿毒清顆粒在臨床治療上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。主要結(jié)果包括：⑴

4、通過本研究發(fā)現(xiàn)尿毒清顆?？梢栽趍RNA和蛋白質(zhì)水平減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)。TGF-β1是引起腎小球硬化的主要介質(zhì),以其為靶向的治療已成為近年來的研究熱點(diǎn)。我們用SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了正常對照組大鼠、病理對照組大鼠和經(jīng)尿毒清治療后大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1及其下游基因mRNA的表達(dá)。為了確證TGF-β1 mRNA在本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)升高是否引起了TGF-β1蛋白表達(dá)的增多,我們用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了

5、大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究各實(shí)驗(yàn)組TGF-β1表達(dá)變化出現(xiàn)的因?yàn)?我們用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測單基因TGF-β1啟動子甲基化狀態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)慢性腎功能衰竭大鼠TGF-β1啟動子有些位點(diǎn)出現(xiàn)了去甲基化現(xiàn)象,而尿毒清顆粒治療組該位點(diǎn)甲基化狀態(tài)得到恢復(fù)。結(jié)果表明尿毒清顆粒對慢性腎功能衰竭的治療是通過下調(diào)以TGF-β1為中心的多基因表達(dá)來進(jìn)行的。⑵生化試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)尿毒清顆?？梢越档吐浴ＤI功能衰竭大鼠血清中同型半胱氨酸

6、濃度,減輕高同型半胱氨酸血癥。慢性腎功能衰竭患者血清同型半胱氨酸水平升高發(fā)生率高達(dá)82.5％,其水平為正常人的2～3倍。高同型半胱氨酸可能通過損害血管內(nèi)皮,刺激血管平滑肌增殖等因?yàn)樵诼阅I功能衰竭發(fā)病機(jī)制中起重要作用。我們用高效液相色譜檢測了正常組對照大鼠、病理對照組大鼠和經(jīng)尿毒清治療后大鼠血清中同型半胱氨酸的含量,發(fā)現(xiàn)與病理對照組相比,經(jīng)尿毒清治療的大鼠血清同型半胱氨酸濃度顯著下降。此結(jié)果揭示了尿毒清顆粒可以通過提高對同型半胱氨酸的清

7、除達(dá)到恢復(fù)慢性腎功能衰竭大鼠腎功能的作用。⑶DNA甲基化研究發(fā)現(xiàn)尿毒清顆?？梢允孤阅I功能衰竭大鼠基因組DNA從低甲基化狀態(tài)恢復(fù)到正常水平。同型半胱氨酸的積累會導(dǎo)致體內(nèi)DNA甲基化異常,本實(shí)驗(yàn)對各組大鼠腎皮質(zhì)基因組DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性腎功能衰竭大鼠腎皮質(zhì)基因組DNA出現(xiàn)了低甲基化現(xiàn)象,尿毒清顆粒治療可以使其恢復(fù)為正常水平。結(jié)果揭示尿毒清顆?？梢酝ㄟ^表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)基因組DNA的甲基化狀態(tài)來對慢性腎功