外源NO在中華壽桃應(yīng)答褐腐菌脅迫中的作用及其蛋白組學(xué)研究.pdf

1、桃（Prunus persica L. Batsch）是典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后極易遭受多種病原菌侵染而腐爛，造成巨大損失。由褐腐菌（Monilinia fructicola）引起的褐腐病是采后桃果實(shí)最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的病害之一。近年來(lái)，利用生物或者非生物因子誘導(dǎo)植物抗病性為控制果實(shí)采后病害開(kāi)辟了新的途徑。其中，一氧化氮（Nitric oxide, NO）在果實(shí)采后病害控制方面的研究受到科研工作者的廣泛關(guān)注，但NO誘導(dǎo)桃果實(shí)抗病性的研

2、究主要集中在生理生化方面，其分子機(jī)理還不甚清楚。因此，我們以中華壽桃為試材，研究了外源NO處理對(duì)采后桃褐腐病的控制效果及相關(guān)酶活性和信號(hào)物質(zhì)積累的影響，分析了NO處理后果實(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的變化，揭示了NO誘導(dǎo)桃果實(shí)提高抗病性的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　?。?）用15μM的NO溶液和清水浸泡果實(shí)后，調(diào)查果實(shí)病斑擴(kuò)展和抗病相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)外源 NO能有效地抑制中華壽桃褐腐病的發(fā)病率和菌斑的擴(kuò)展，顯著誘導(dǎo)了果實(shí)PPO、POD活性的升高

3、和內(nèi)源NO、JA的積累，有利于抗病性的提高和抗病信號(hào)的傳遞。
　　（2）選取接種后12h和24h的桃果實(shí)，利用TMT技術(shù)進(jìn)行定量蛋白組學(xué)分析，共鑒定到5779種蛋白質(zhì)，其中5149種可以定量。以差異倍數(shù)值變化超過(guò)1.3倍作為顯著上調(diào)、小于0.77倍作為顯著下調(diào)的變化標(biāo)準(zhǔn)，在接種后12h篩選出576種差異表達(dá)蛋白，其中420（73％）種發(fā)生上調(diào)，156種發(fā)生下調(diào)（27%）；在接種后24h篩選出114種差異表達(dá)蛋白，其中73（64%）

4、種發(fā)生上調(diào)，41（36%）種發(fā)生下調(diào)。在接種后24h時(shí)差異表達(dá)蛋白的數(shù)量減少特別是上調(diào)蛋白的數(shù)量，說(shuō)明此時(shí)桃果實(shí)中響應(yīng)褐腐菌入侵的蛋白質(zhì)數(shù)量減少，因此我們選取接種后12h的蛋白組數(shù)據(jù)為生物信息學(xué)分析對(duì)象來(lái)探索NO的誘導(dǎo)抗病機(jī)制。
　?。?）亞細(xì)胞定位分析表明，接種后12h的差異表達(dá)蛋白主要位于葉綠體（270個(gè)）和細(xì)胞質(zhì)（114個(gè)）中，其它差異蛋白位于細(xì)胞核（88個(gè)）、質(zhì)膜（35個(gè)）、線粒體（21個(gè)）、胞外（18個(gè)）、液泡膜（12個(gè)

5、）、細(xì)胞骨架（9個(gè)）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（5個(gè)）、高爾基體（2個(gè)）、過(guò)氧化物酶體（2個(gè)）和細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核（1個(gè)）中。將差異蛋白根據(jù)GO、KEGG通路富集分析和人工搜索進(jìn)行了功能分類，這些蛋白主要涉及信號(hào)感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal perception and signal transduction,17%）、ROS平衡及防御相關(guān)蛋白（ROS homeostasis and defense-related proteins,22%）、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水

6、平調(diào)節(jié)（Transcription and post-transcriptional regulation,24%）、碳水化合物和能量代謝（Carbohydrate and energy metabolism,13%）、氨基酸代謝和脂類代謝（Amino acid and lipid metabolism,24%）過(guò)程。
　　（4）隨機(jī)選擇8個(gè)接種后12h的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因克隆以及qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)差異蛋白中有6個(gè)差異

7、蛋白所對(duì)應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生了上調(diào)，與蛋白水平得到的結(jié)果一致，從轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了蛋白組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
　　研究結(jié)果表明，15μM外源NO處理誘導(dǎo)了采后中華壽桃的防御系統(tǒng)，抑制了褐腐病的發(fā)生。在外源NO作用下，采后桃果實(shí)褐腐菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多細(xì)胞器、多信號(hào)途徑的復(fù)雜過(guò)程。首先，褐腐菌脅迫的信號(hào)感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活，并通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控下游蛋白的表達(dá)；第二，活性氧平衡系統(tǒng)啟動(dòng)并與褐腐菌響應(yīng)蛋白協(xié)同作用；第