急性髓系白血?。∕2a）骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及預(yù)后意義.pdf

1、研究背景及目的：盡管目前急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)的治療取得了顯著的進(jìn)步，但仍有20％～40％的患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療未能達(dá)到完全緩解(completeremission，CR)，即使獲得CR的患者，在鞏固化療后仍有70％左右復(fù)發(fā)或發(fā)展為難治性急性髓系白血病(refractoryAML)而治療無(wú)效死亡。因此，研究復(fù)發(fā)/難治AML的早期判斷預(yù)后指標(biāo)成為白血病領(lǐng)域的一個(gè)重要的課題。由于蛋白質(zhì)是生理、病理過

2、程的直接執(zhí)行者，疾病的不同種類和同一疾病的不同分型或分期也必然表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，故結(jié)合臨床實(shí)際研究蛋白質(zhì)變化更具有實(shí)用意義。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使用高通量的方法分析細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)成為現(xiàn)實(shí)，并且蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在白血病領(lǐng)域中也越來(lái)越受到重視，主要研究涉及內(nèi)容包括不同類型白血病的差異性研究，白血病細(xì)胞系的研究，藥物對(duì)白血病細(xì)胞作用等方面，但應(yīng)用該技術(shù)研究急性白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)組與臨床預(yù)后的關(guān)系至今尚未見報(bào)告。 本文通過比較首次持續(xù)完

3、全緩解(firstcontinuouscompleteremission，CCR1)時(shí)間相差顯著的AML-M2a患者誘導(dǎo)治療前及其復(fù)發(fā)患者的白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況，來(lái)探討AML-M2a患者白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)特征及其在預(yù)后中的價(jià)值，為進(jìn)一步研究難治性AML-M2a的早期診斷和設(shè)計(jì)新的治療方案提供依據(jù)。 方法： 1.研究對(duì)象17例初診的AML-M2a患者為2003年10月-2005年5月的住院患者。中位年齡34歲(1

4、6～56歲)，男12例，女5例，全部病例均為原發(fā)性AML，無(wú)多系增生異常，在誘導(dǎo)化療前檢查染色體核型正常，外周血WBC＜100×109/L，免疫表型主要表達(dá)CD13+CD33+，伴隨表達(dá)CD117+或CD14+或CD11b+或CD7+或CD19+，誘導(dǎo)化療方案包括DA、TA、MA和HA，獲緩解后鞏固化療方案包括DA、TA、MA、HA、IA、MEA和IDAra-C，每30～43天鞏固一療程，化療間歇期常規(guī)進(jìn)行CNS的白血病預(yù)防，中位隨訪時(shí)

5、間13個(gè)月(10～15個(gè)月)。17例患者在開始化療前留取骨髓細(xì)胞，依據(jù)首次持續(xù)完全緩解(CCR1)時(shí)間分組，大于12個(gè)月者為A組(11例)，小于6個(gè)月者為B組(6例)，B組患者中有3例在復(fù)發(fā)時(shí)留取的骨髓細(xì)胞為C組。A組和B組白血病細(xì)胞占有核細(xì)胞比例的中位數(shù)為86％(82％～93％)，C組初診和復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞占有核細(xì)胞比例的中位數(shù)為81％(66％～84％)。 2.雙向電泳采用裂解液凍融法提取單個(gè)核細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳

6、，透射掃描凝膠圖像。應(yīng)用ImageMaster2DEliteV5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析比較，經(jīng)背景消減、蛋白點(diǎn)配比校正與歸一化處理后，根據(jù)蛋白點(diǎn)的體積的變化，來(lái)判斷蛋白點(diǎn)表達(dá)量的變化，標(biāo)記出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。 3.質(zhì)譜分析挖取其中一些差異相對(duì)明顯的蛋白點(diǎn)，進(jìn)行膠內(nèi)酶切，再對(duì)獲得的肽段進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。 4.蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)查詢對(duì)所得的肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)分析，明確蛋白質(zhì)的類型及性質(zhì)。 5.統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)分析應(yīng)用spss10.0軟件，A組和B組差異點(diǎn)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，C組初診和復(fù)發(fā)時(shí)的差異點(diǎn)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.雙向電泳過程中每份標(biāo)本重復(fù)3次，獲得較好的重復(fù)性。用ImageMaster2DEliteV5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，將每例患者3張重復(fù)膠擬合成1張平均膠，結(jié)果顯示A組、B組、C組分別有(851±50)、(834±37)、(841±3

8、1)個(gè)蛋白點(diǎn)被檢測(cè)，其等電點(diǎn)大都分布在3～10之間，分子量集中在14～43KD之間。以B組中的一例平均膠作為參考圖像，應(yīng)用ImageMaster2DEliteV5.0軟件設(shè)定差異倍數(shù)≥2倍為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)表達(dá)水平高低。A組與B組比較，A組有15個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平升高，9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平降低；C組誘導(dǎo)治療前和復(fù)發(fā)時(shí)比較，復(fù)發(fā)時(shí)有15個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平升高，4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平降低。所有差異蛋白點(diǎn)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.

9、通過質(zhì)譜分析，從選取的A組和B組蛋白差異點(diǎn)中鑒定出6個(gè)蛋白質(zhì)，其名稱為：tubulin-specificchaperoneB，myeloperoxidase，theCHdomainofhumantransgelin-2，glutathioneS-transferas，zincfingerprotein，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase。C組初診和復(fù)發(fā)時(shí)自身對(duì)照比較，3個(gè)蛋白點(diǎn)得到鑒定，其名稱

10、為：NAD(P)Hdehydrogenase，hypotheticalprotein，HES1。 結(jié)論： 1.CCR1相差顯著的AML-M2a患者初診組間白血病細(xì)胞的蛋白質(zhì)存在表達(dá)差異，其中tubulin-specificchaperoneB、myeloperoxidase、zincfingerprotein、glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase在CCR1時(shí)間大于12個(gè)月的AML

11、-M2a患者(A組)中表達(dá)增高，其預(yù)后較好；theCHdomainofhumantransgelin-2和glutathioneS-transferas在CCR1時(shí)間小于6個(gè)月的AML-M2a患者(B組)中表達(dá)增高，預(yù)后較差。鑒定的6個(gè)差異蛋白可能與AML-M2a首次持續(xù)完全緩解時(shí)間有關(guān)，對(duì)判斷預(yù)后具有一定的價(jià)值。 2.CCR1小于6個(gè)月的AML-M2a患者初診與復(fù)發(fā)時(shí)的白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)也存在差異，其中NAD(P)Hdehydr