結核桿菌兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6協(xié)同對宿主細胞的影響及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、結核分枝桿菌在宿主細胞內(nèi)長期寄生可以引起結核病。小分子分泌蛋白CFP-10和ESAT-6是結核分枝桿菌的毒力因子,在結核分枝桿菌感染和致病的過程中發(fā)揮了重要作用。在結核分枝桿菌感染宿主寄生于胞內(nèi)的過程中,結核分枝桿菌的兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6在宿主細胞中發(fā)揮作用的機制仍不清楚。本課題組前期構建了CFP-10-PEGFP-N1和ESAT-6-PEGFP-N1真核表達載體,分別轉染真核細胞,初步觀察了兩個毒力因子單獨作用對宿主

2、細胞凋亡的影響。
  目的:在前期研究的基礎上,本實驗采用基因工程技術構建了荷有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1,與荷有綠色熒光報告基因的ESAT-6-PEGFP-N1共同轉染真核細胞,獲得CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細胞內(nèi)表達的細胞模型,進而初步探討結核分枝桿菌毒力因子CFP-10、ESAT-6協(xié)同對細胞凋亡相關基因表達的影響。
  方法:雙酶切CFP-10-PEGFP-N1真核重組表達質粒

3、,獲得CFP-10基因片段,將CFP-10基因插入 PDsRed1-N1真核表達載體,構建含有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1真核重組表達載體。按照以下分組形式:
  1.PEGFP-N1組
  2.PDsRed1-N1組
  3.PEGFP-N1和PDsRed1-N1雙轉染組
  4.CFP-10-PDsRed1-N1組
  5.ESAT-6-PEGFP-N1組
  6.CFP-

4、10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉染組
  7.脂質體組
  8.空白對照組
  采用脂質體方法轉染293FT細胞,通過倒置熒光顯微鏡觀察轉染后細胞出現(xiàn)的熒光情況,用Western Blot方法檢測轉染后細胞內(nèi)CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白的表達狀況,利用激光共聚焦顯微技術觀察分析轉染后的細胞中CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白共定位的情況。用實時定量PCR技術檢測四個凋亡相關基因Bcl

5、-2、Bax、Caspase-8、Caspase-3在轉染前后細胞內(nèi)的動態(tài)表達情況。
  結果:構建獲得了序列正確的CFP10-PDsRed1-N1真核重組表達載體;獲得了結核分枝桿菌兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表達的真核細胞模型,通過倒置熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)轉染后的293FT細胞能夠分別發(fā)出紅色熒光和綠色熒光;Western Blot檢測結果證實融合蛋白PDSRED-CFP-10和PEGFP-ESAT-6在

6、轉染的細胞中獲得表達,通過激光共聚焦顯微技術觀察,又發(fā)現(xiàn)轉染空質粒 PEGFP-N1和PDsRed1-N1組293FT細胞的紅色熒光和綠色熒光主要分布在細胞質中,經(jīng)merge后在細胞的一部分區(qū)域的紅色熒光和綠色熒光疊加為黃色,另外一部分區(qū)域仍保持紅色熒光,提示紅色熒光與綠色熒光分布不完全一致;轉染 CFP10-PDsRed1-N1和ESAT6-PEGFP-N1組293FT細胞黃色熒光也分布于細胞質,經(jīng)merge后在胞質中均為黃色,提示紅

7、色熒光與綠色熒光分布一致。采用熒光實時定量PCR檢測四個凋亡相關基因在轉染前后細胞內(nèi)的動態(tài)表達的結果顯示,CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉染組的細胞中,轉染后24 h的Bcl-2基因的表達量比轉染后12 h增加幅度大,轉染后24 h的Bax基因的表達量比轉染后12 h增加幅度小,且Bax/Bcl-2比率變化呈下降趨勢,并在24 h降低幅度大。在CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEG

8、FP-N1雙轉染組的細胞中,轉染后24 h的Caspase-8基因表達量比轉染后12 h降低幅度大,與此同時,轉染后24 h的Caspase-3基因的相對表達量比轉染后12 h降低幅度大,且隨時間的增加,總體呈現(xiàn)降低的趨勢。
  結論:獲得CFP-10-PDsRed1-N1真核重組表達載體能夠在真核細胞中正確表達,成功構建了兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細胞內(nèi)表達的細胞模型,CFP-10基因和ESAT-6基因

9、在同一個細胞內(nèi)表達互不干擾,其蛋白產(chǎn)物在細胞中的分布是一致的,提示這兩個毒力因子在細胞內(nèi)可能是以復合物的形式存在和發(fā)揮作用。采用熒光實時定量PCR對各組細胞進行凋亡相關基因檢測,結果發(fā)現(xiàn)CFP-10/ESAT-6復合物可能影響細胞內(nèi)的 Bax/Bcl-2比率,使之下降。CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉染組和 PEGFP-N1和 PDsRed1-N1雙轉染組 Caspase-8和Caspase-3基因

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