大骨雞MSTN基因的真核表達(dá).pdf

1、肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)是Mcpherron等研究小鼠轉(zhuǎn)化生長因子一p(TGF-β)超家族時發(fā)現(xiàn)的一種新的生長因子。該基因編碼的蛋白質(zhì)對骨骼肌有負(fù)調(diào)控作用，動物缺乏MSTN出現(xiàn)肌肉增大，骨骼肌肌群分布廣，而且不增生成脂肪等現(xiàn)象。任何可以干擾MSTN基因表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物活性的措施，都可能影響肌肉的正常發(fā)育。利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核基因，進(jìn)而研究該基因的結(jié)構(gòu)與功能是分子生物學(xué)技術(shù)也是基因工程的重要內(nèi)容。 在本論文

2、中，作者通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)其在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中表達(dá)。主要研究內(nèi)容如下： 根據(jù)原實驗結(jié)果中雞MSTN基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計了一對引物，以本實驗室提供的質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為1128kb。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后被克隆到pMD18-T Simple Vector克隆載體中。從pMD18-MSTN-T重組質(zhì)粒上切下目的片段，然后與用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切處理

3、過的真核表達(dá)載體pCDNA3.0進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pCDNA-MSTN-3.0，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定其正確性，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞。制作雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)時選用9～12日齡的雞胚，當(dāng)CEF的數(shù)量達(dá)到培養(yǎng)瓶瓶底的75％時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將上述鑒定為陽性的表達(dá)重組質(zhì)粒pCDNA-MSTN-3.0通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后18、24、30、36小時后，用胰酶消化，待全部貼壁的雞胚成纖維細(xì)胞全部脫落下來時反復(fù)凍融收集上