辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病多效作用的實驗和臨床研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(COPD)居全球死亡原因的第4位，據(jù)2003年統(tǒng)計，中國COPD的患病率達(dá)8.2％（≥40歲）。在未來的幾十年內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率將會進(jìn)一步上升。一直以來，吸煙被認(rèn)為是導(dǎo)致COPD發(fā)病最重要和最常見的的危險因素。有關(guān)吸煙致COPD發(fā)病的機(jī)制不甚完全清楚。COPD特征性病理改變是小氣道疾?。ㄗ枞约?xì)支氣管炎）和肺實質(zhì)破壞（肺氣腫）。早在1959年，Liebow研究發(fā)現(xiàn)小葉中央型肺氣腫的肺泡隔很薄，幾乎沒有血管，就提出肺泡

2、毛細(xì)血管血供減少可能導(dǎo)致肺泡隔的減少。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體KDR抑制劑SU5416給大鼠皮下注射3周后，可見大鼠肺泡隔內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，肺氣腫發(fā)生，由此說明中斷VEGF的信號傳導(dǎo)(即是VEGF表達(dá)減少或/和封閉VEGFR)與肺氣腫發(fā)生有關(guān)。VEGF是一組功能強(qiáng)大且能產(chǎn)生多種效應(yīng)的細(xì)胞因子，參與了肺的生理和病理過程，是維持肺泡結(jié)構(gòu)的中心環(huán)節(jié)。由于COPD發(fā)病機(jī)理不甚明朗，導(dǎo)致治療上沒有突破性的進(jìn)步。到目前為

3、止，對COPD的治療以吸入β2受體興奮劑、激素類藥物及茶堿類為常規(guī)用藥，這些藥物僅能緩解癥狀及在一定程度上改善COPD患者的肺功能和生活質(zhì)量，但無法逆轉(zhuǎn)病理進(jìn)程。尋求治療COPD的新藥一直是學(xué)者們不懈追求的目標(biāo)。
　　他汀類(Statins)為羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的特異競爭性抑制藥，可減少膽固醇的生物合成。除其降低膽固醇外，還有其它的藥理作用，可能有益于CODP的治療。如抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善內(nèi)皮功

4、能、抗血栓形成和抑制平滑肌增殖的多效性作用。這些多效作用是通過抑制異戊二烯化的小分子GTP結(jié)合信號分子，如Rho，Ras和Rac的機(jī)制來實現(xiàn)的。其中Statins類的抗炎效應(yīng)主要包括抑制前炎性細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和炎性細(xì)胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶。此外，Statins可以增加VEGF的分泌和內(nèi)皮一氧化氮合成酶的表達(dá)和活性，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血管生成素產(chǎn)生?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)Statins可以減輕COPD的急性加重和死亡率。這說明

5、Statins在慢性肺部炎癥性疾病中的作用應(yīng)更深入的研究。
　　本研究其一，采用辛伐他汀治療煙霧所致大鼠肺氣腫模型，觀察肺組織的病理形態(tài)變化及PCNA、VEGF的表達(dá)情況;其二，利用COPD急性加重期患者(AECOPD)和辛伐他汀治療后AECOPD患者的誘導(dǎo)痰標(biāo)本，分析誘導(dǎo)痰中VEGF水平的變化，以及其與肺功能的相關(guān)性。試圖從實驗動物和臨床患者兩個不同層面入手，探討辛伐他汀對COPD的作用。
　　材料和方法:
　　一、

6、實驗材料
　?。ㄒ唬﹦游镌囼灢糠?
　　24只健康雌雄各半Wistar大鼠，鼠齡12w，體重190～220g，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，許可證號:SVXK（遼）2003-0009
　　（二）臨床實驗對象:
　　1、選擇2006.1-2007.3月年住院病例。AECOPD組25例，診斷均符合2002年中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會制定的慢性阻塞性肺疾病診治規(guī)范;哮喘組16例，診斷符合2003年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制

7、定的支氣管哮喘防治指南;健康對照組14例。
　　2、選擇2007.5-2008.11月住院的58例AECOPD患者，診斷均符合2007年修訂版中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會制定的慢性阻塞性肺疾病診治規(guī)范。將58例AECOPD患者隨機(jī)分為常規(guī)治療組（RT組）30例;常規(guī)+他汀治療組（RST組）28例。
　　二、實驗步驟
　　（一）動物試驗部分:
　　1、分組:
　　將健康雌雄各半Wistar大鼠24只隨機(jī)分為注射用水對照

8、組(W)，吸煙組(Sm)，單純用藥組(St)，吸煙+藥物組(SmSt)。不同組別在同一時間進(jìn)行不同的操作如W組和Sm組以等劑量注射用水灌胃;Sm組和SmSt組暴露于有煙環(huán)境;St組和SmSt組將辛伐他汀溶于注射用水中，灌于大鼠胃內(nèi)(5 mg/kg/d)。
　　2、標(biāo)本采集:
　　(1)支氣管肺泡灌洗液(BALF):將16周后的各組大鼠麻醉后處死，進(jìn)行氣管插管，夾閉其右主支氣管，緩慢注入0℃生理鹽水2 ml灌注左肺，反復(fù)3次，

9、取上清液-70℃保存。
　　(2)大鼠肺組織:取右肺葉，由肺門至肺緣作最大切面。部分肺組織液氮保;余下肺組織浸泡于10％中性福爾馬林固定4小時，常規(guī)制備5μm石蠟切片，待HE染色常規(guī)病理學(xué)檢查如①氣道炎癥病理評分;②肺泡腔及肺泡密度病理評分和免疫組化檢測使用。
　　3、BALF及肺組織勻漿VEGF的測定:
　　標(biāo)本嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測BALF和肺組織勻漿VEGF的含量（試劑盒購自美國Santa Cruz公

10、司）。
　　4、VEGF和PCNA免疫組化檢測:
　　采用增強(qiáng)型非生物素標(biāo)記二步法（Polymer Helper二步法），按照VEGF和PCNA試劑盒（美國Santa Cruz公司產(chǎn)品）說明書操作，DAB顯色，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性物作陽性對照。結(jié)果判定:VGEF染色以細(xì)胞質(zhì)棕色為陽性; PCNA染色以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。
　　5、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定肺組織中VEGF

11、 mRNA的表達(dá)
　　(1)應(yīng)用TAKARA試劑盒提取大鼠組織總RNA。
　　(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(TAKARA RNA PCRKit(AMV) Ver3.0)
　　(3) PCR反應(yīng)
　?。ǘ┡R床實驗部分:
　　1、標(biāo)本采集:
　　(1)痰標(biāo)本的收集:采用Nightingale方法誘導(dǎo)深部痰2 ml，取上清液于-70℃冰箱保存待測。
　　(2)血標(biāo)本均于入院第一天和治療一周后清晨臥位患者的靜脈血

12、2 ml，留取血清于-70℃冰箱保存待測。
　　2、肺功能測試:
　　美國SensormedicsVmax229型心肺動、靜態(tài)肺功能儀測定FEV1、FEV1/FVC。
　　3、誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)及其分類計數(shù):
　　采用Neubauer法計數(shù)炎癥細(xì)胞總數(shù)(TCC)和鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)量，并細(xì)胞涂片經(jīng)H-E染色計數(shù)分類400個非鱗狀上皮細(xì)胞。
　　4、血清、痰上清液中VEGF濃度測定:
　　檢測VEGF的水平采

13、用ELISA法
　　結(jié)果:
　　1、小氣道炎癥的病理學(xué)改變
　　Sm組大鼠支氣管壁是以淋巴細(xì)胞浸潤為主。管壁炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀上皮細(xì)胞增生肥大，氣道平滑肌增殖紊亂與W組比有明顯的不同，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01， P＜0.01)。SmSt組支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤，杯狀上皮細(xì)胞增生肥大，氣道平滑肌增殖紊亂的病理學(xué)改變較吸煙組有減輕(P＜0.01，P＜0.01P＜0.01)。SmSt組氣道炎癥病理學(xué)總

14、分與Sm組(P＜0.0.05)比較有差異，并近似于W組的變化。
　　2、肺組織學(xué)觀察
　　慢性香煙暴露16周后，Sm組見肺實質(zhì)破壞，肺泡大小不等，肺泡壁變薄，部分肺泡腔融合擴(kuò)大。Sm組MLI增加，是W組135％; Sm組MAN下降，是W組60％。Sm組的MLI和MAN與W組比差異有顯著意義（P＜001），(P＜0.01)。SmSt組MIL有明顯的降低，MNA有明顯的增加，接近于W組的水平。SmSt組MLI，MNA與Sm組比差

15、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.05)。
　　3、支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA的表達(dá)SmSt組肺泡上皮細(xì)胞PCNA陽性細(xì)胞百分比明顯高于Sm組，與Sm組或W組比差異有顯著意義(P＜0.01orP＜0.01)。St組肺泡上皮細(xì)胞PCNA陽性細(xì)胞百分比與Sm組比有顯差著性差異(P＜0.01)。支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA陽性標(biāo)記細(xì)胞各組無明顯差異。
　　4、大鼠肺VEGFaRT-PCR結(jié)果（定性結(jié)果）

16、
　　Sm組VEGF的表達(dá)與W組比較有明顯的降低，SmSt組VEGF表達(dá)恢復(fù)接近W組VEGF的水平。
　　5、大鼠肺組織中VEGF的水平（定量結(jié)果）
　　Sm組BALF和組織勻漿中VEGF水平較W組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01)。SmSt組與St組和W組VEGF水平接近，SmSt組與Sm組比差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。
　　6、支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)（

17、定位結(jié)果）
　　W組大鼠肺內(nèi)VEGF陽性染色主要分布在肺泡和支氣管上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞僅有少量表達(dá)。Sm組大鼠肺泡和支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯下降與W組比較有顯著的差異（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。SmSt組大鼠肺泡和支氣管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，與Sm組比有顯著差異（P＜0.01，P＜0.01），近似于W組VEGF表達(dá)的水平。
　　7、受試者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)及分?jǐn)?shù)計數(shù)
　　A

18、ECOPD患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)明顯高于其他組，與對照組比有明顯差異(P＜0.01)。在細(xì)胞分?jǐn)?shù)計數(shù)中，COPD急性加重期患者嗜中性粒細(xì)胞明顯高于對照組(P＜0.01)，哮喘組患者嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞明顯高于對照組(P＜0.01，P＜0.01)。
　　8、受試者誘導(dǎo)痰中VEGF水平以及與FEV1％的關(guān)系
　　哮喘組患者誘導(dǎo)痰中VEGF含量明顯高于對照組(P＜0.01)，AECOPD組患者誘導(dǎo)痰中VEGF含量低于哮喘組和

19、對照組（P＜0.01）。哮喘組誘導(dǎo)痰中VEGF含量與FEV1％呈負(fù)相關(guān)(r=-0.301，P＜0.05)，AECOPD組誘導(dǎo)痰中VEGF含量與FEV1％呈正相關(guān)(r=0.116，P＜0.05)。
　　9、RT組與RST組治療一周后各指標(biāo)的比較
　　無論RT組還是RST組治療一周后的肺功能FEV1或FEV1/FVC都有明顯的增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01， P＜0.01)。誘導(dǎo)痰VEGF的水平兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)

20、意義（P＜0.05）。
　　10、RST組治療前后各指標(biāo)的比較
　　RST組治療一周后的各項指標(biāo)均比治療前增加。肺功能FVE1或FVE1/FVC治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01)。誘導(dǎo)痰中VEGF的水平治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜001）。
　　11、RST組治療后血和誘導(dǎo)痰VEGF與FEV1％，F(xiàn)EV/FVC的關(guān)系
　　治療后血VEGF的水平與FEV1％，F(xiàn)EV/FVC無相關(guān)性（r

21、=0.170 P＞0.05）。治療后誘導(dǎo)痰VEGF水平與FEV1％，F(xiàn)EV/FVC呈正相關(guān)(r=0.430 P＜0.05，r=0.388 P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、辛伐他汀在有效和安全的藥物濃度下（5 mg.kg-1day-1），除具有抗炎，減輕支氣管重構(gòu)外，可促進(jìn)煙霧所致大鼠肺氣腫肺泡上皮細(xì)胞增殖，直接使已損傷的肺泡結(jié)構(gòu)再生，逆轉(zhuǎn)煙霧所致肺氣腫的進(jìn)一步發(fā)展;其次可上調(diào)VEGF在支氣管和肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了

22、煙霧誘導(dǎo)的VEGF含量的減少，間接促進(jìn)煙霧所致大鼠肺氣腫肺泡上皮細(xì)胞的增殖，對肺氣腫的進(jìn)行性發(fā)展起到保護(hù)性作用?？梢娦练ニ】赡芫哂懈纳艭OPD病理進(jìn)程和緩解COPD臨床表現(xiàn)。這種潛在作用可能是COPD治療的新靶點。
　　2、支氣管哮喘和COPD患者VEGF的水平是不同的，說明VEGF對兩者發(fā)病過程起到的作用是不同。VEGF水平的降低與COPD患者氣流受限和肺泡破壞有關(guān)，可能參與COPD發(fā)病過程。
　　3、辛伐他汀可以改善A