豬前體脂肪細胞與肌衛(wèi)星細胞聯(lián)合培養(yǎng)體系建立及生長特性初步研究.pdf

1、脂肪組織與肌肉組織通過旁分泌、內(nèi)分泌產(chǎn)生相互作用，參與機體脂肪沉積與肌肉發(fā)育過程，在物質(zhì)與能量代謝過程中具有重要調(diào)節(jié)功能，建立脂肪細胞與肌細胞的聯(lián)合培養(yǎng)體系，有助于研究兩類細胞間的作用關(guān)系。 本實驗以初生健康長白仔豬為實驗動物，分離、純化前體脂肪細胞與骨骼肌肌衛(wèi)星細胞，采用MTT比色、油紅O染色、Desmin免疫組化、HE染色和半定量RT-PCR等方法，建立了一種豬前體脂肪細胞與肌衛(wèi)星細胞體外直接聯(lián)合培養(yǎng)的適宜體系，并對聯(lián)合培養(yǎng)

2、細胞的增殖分化等生長特性進行了初步研究，得出如下研究結(jié)果： 1.比較了接種濃度比對聯(lián)合培養(yǎng)細胞增殖率的影響。在13個接種濃度比中，MTT比色結(jié)果顯示，當(dāng)前體脂肪細胞與肌衛(wèi)星細胞以2.5×10<'7>個/L與1×10<'8>個/L接種時，聯(lián)合培養(yǎng)細胞在測定第9天的增殖率可達到最大。 2.分析了貼壁時間對聯(lián)合培養(yǎng)細胞存活率的影響。隨培養(yǎng)時間的延長，聯(lián)合培養(yǎng)細胞貼壁率增大，但在48～66 h間趨于穩(wěn)定，66 h后部分細胞進入增

3、殖分裂期。 3.研究了培養(yǎng)基及血清濃度對聯(lián)合培養(yǎng)細胞存活率的影響。細胞貼壁率結(jié)果顯示，有血清培養(yǎng)基較無血清培養(yǎng)基有利于細胞的存活，其中DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基較DMEM、RPMI及M199培養(yǎng)效果好，聯(lián)合培養(yǎng)細胞存活率在10～200 mL/L的范圍內(nèi)呈濃度依賴性。 4.分析了聯(lián)合培養(yǎng)細胞生長形態(tài)與增殖特性的變化。形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察、2～9天MTT比色結(jié)果顯示，聯(lián)合培養(yǎng)細胞貼附后呈纖維樣伸展延伸，增殖率高于單獨兩類細胞

4、，但接觸匯合后交織重疊生長，7～9天維持緩慢的增殖過程，進入平臺期較單獨兩類細胞晚。 5.形態(tài)學(xué)觀察聯(lián)合培養(yǎng)對脂肪細胞與肌細胞分化過程的影響。油紅O染色、HE染色結(jié)果顯示，聯(lián)合培養(yǎng)細胞中僅觀察到極少量的小脂滴，且呈現(xiàn)較晚；多核肌細胞形成與肌管的融合在聯(lián)合培養(yǎng)中顯著，但沒有單獨肌細胞明顯，且形成較晚； 6.分子水平RT-PCR.檢測聯(lián)合培養(yǎng)對脂肪細胞與肌細胞分化過程的影響。第5、10天的聯(lián)合培養(yǎng)細胞皆表達LPL、Myf5