SOCS-1對TNF-α誘導(dǎo)人近端腎小管上此細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：目前我國腎臟疾病，尤其是糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率不斷上升。DN是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)展至晚期往往會導(dǎo)致終末期腎功能衰竭，嚴(yán)重威脅人類的健康。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及到遺傳、代謝、生長因子、細(xì)胞因子等多種因素。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)可能為參與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)不可忽視的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。在DN動物模型和DN患者中，TNF-α的表達(dá)水平均有升高，提示TNF-α參與了DN的發(fā)生

2、與發(fā)展。TNF-α由157個(gè)氨基酸構(gòu)成，除造血細(xì)胞外，腎臟固有細(xì)胞（主要是系膜細(xì)胞、腎小球細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等）也可產(chǎn)生TNF-α。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，與細(xì)胞的分化、增殖及凋亡有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α可以誘導(dǎo)負(fù)鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。但有關(guān)TNF-α能否誘導(dǎo)人腎近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的研究卻鮮見報(bào)道。
　　 Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號途徑是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，

3、在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。STAT是JAK激酶的底物，與酪氨酸磷酸化信號通路耦聯(lián)，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)家族是一類由細(xì)胞產(chǎn)生、可反饋性阻斷細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其對JAK/STAT信號通路起負(fù)調(diào)控作用。SOCS可能通過抑制JAK/STAT信號對DN發(fā)揮保護(hù)作用。現(xiàn)在盡管已經(jīng)證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與JNK及NF-κB兩條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，但對于JAK/STAT信號通路

4、是否也在其中發(fā)揮一定的作用以及SOCS-1干預(yù)后能否抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等問題卻知之甚少。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)著重觀察了TNF-α對人腎近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)凋亡和JAK/STAT信號激活的影響以及JAK/STAT信號特異性阻斷劑(AG490)和SOCS-1過表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和JAK/STAT通路的影響。初步探討TNF-α誘導(dǎo)HKC凋亡及凋亡過程中JAK/STAT信號通路的激活和SOCS-1基因的作用等

5、問題，以期為DN的防治提供新的依據(jù)和策略。
　　 方法：
　　 1、材料：人腎近端腎小管上皮細(xì)胞株HKC;pCR3.1-SOCS-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人腎近端腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞系；pCR3.1-vector空質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人腎近端腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞系；TNF-α;AG490。
　　 2、方法
　　 2.1用甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定HKC細(xì)胞株的增殖情況，以確定TNF-α的半數(shù)抑制濃度(IC50):設(shè)立空白對照組（

6、control）、溶劑對照組(solvent)、藥物組；藥物濃度為5ng.ml-1，10ng.ml-1，20ng.ml-1，40ng.ml-1，80ng.ml-1，160ng.ml-1。作用時(shí)間：24h，測定IOD值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，根據(jù)公式確定IC50，作為本實(shí)驗(yàn)中TNF-α的刺激濃度。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成5組，分別為：對照組(N);TNF-α組(T);TNF-α+AG490組(T+A)；TNF-α+pCR

7、3.1-SOCS-1轉(zhuǎn)染組(T+S1)；TNF-α+pCR3.1-vector空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(T+V)；分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)及刺激后收集細(xì)胞，進(jìn)行觀察檢測。
　　 2.3檢測指標(biāo)
　　 2.3.1流式細(xì)胞定量檢測技術(shù)(FCM)檢測各組細(xì)胞凋亡率。
　　 2.3.2瓊脂糖凝膠電泳(DNA Ladder)檢測細(xì)胞凋亡。
　　 2.3.3末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸-生物素缺口末端標(biāo)記法(TUNEL

8、)檢測各組細(xì)胞凋亡率。
　　 2.3.4應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot)方法檢測各組細(xì)胞p-STAT1、p-JAK2蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、TNF-α對HKC細(xì)胞株增殖的影響MTT法測定顯示：TNF-α作用于HKC細(xì)胞24h，IC50為18.59ng.mL-1。TNF-α對HKC細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且隨著藥物濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)藥物濃度達(dá)到160ng.mL-1時(shí)，TN

9、F-α的抑制率接近80％。溶劑對細(xì)胞的生長未見明顯影響。
　　 2、TNF-α誘導(dǎo)HKC凋亡及其對p-STAT1、p-JAK2蛋白表達(dá)的影響：FCM、DNA Ladder、 TUNEL等檢測顯示：與對照組相比，TNF-α刺激HKC6h后凋亡率顯著增加，12h達(dá)到高峰，之后逐漸回落，但仍高于對照組。Western Blot結(jié)果表明，與對照組相比，TNF-α刺激后HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白表達(dá)升高，以刺激12h時(shí)表達(dá)最

10、高，而后回落，但仍高于對照組。
　　 3、AG490對TNF-α誘導(dǎo)的HKC凋亡和p-STAT1、p-JAK2蛋白表達(dá)的影響：FCM、DNA Ladder、 TUNEL等結(jié)果顯示：與同期T組相比，T+A組的凋亡率顯著下降，但仍高于對照組。Western Blot結(jié)果表明，與同期T組相比，T+A組p-STAT1、p-JAK2蛋白的表達(dá)顯著降低，但仍高于對照組。
　　 4、SOCS-1過表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)的HKC凋亡和p-

11、STAT1、p-JAK2蛋白表達(dá)的影響：FCM、DNA Ladder、TUNEL等結(jié)果顯示：與同期T組相比，T+V組的凋亡率無明顯差異，而T+S1組的凋亡率則顯著下降，但仍高于對照組。Western Blot顯示：與同期T組相比，T+S1組p-STAT1和p-JAK2蛋白的表達(dá)降低，T+V組兩種蛋白的表達(dá)與T組相比無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、TNF-α對HKC生長的抑制作用呈劑量依賴性，并可誘導(dǎo)其凋亡。經(jīng)TNF

12、-α作用后，HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表達(dá)水平升高。AG490干預(yù)后能抑制TNF-α誘導(dǎo)的HKC凋亡，并下調(diào)HKC中p-STAT1和p-JAK2蛋白的表達(dá)水平，提示JAK/STAT信號途徑可能參與了TNF-α誘導(dǎo)的HKC凋亡。
　　 2、過表達(dá)SOCS-1基因能抑制TNF-α誘導(dǎo)的HKC凋亡及p-STAT1和p-JAK2蛋白的表達(dá)，提示SOCS-1基因可能通過對JAK/STAT信號途徑的負(fù)反饋?zhàn)饔靡种芓NF-α誘