輪狀病毒NSP4及其表位肽在膽管閉鎖鼠模型損傷中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、本課題擬對(duì) NSP4及其 CTL表位激活 CD8+淋巴細(xì)胞、繼而形成對(duì)膽管上皮細(xì)胞的特異性殺傷作用進(jìn)行研究,從而弄清 NSP4導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)理,為免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生率及改善膽道閉鎖的預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。
　　如果能找到 NSP4的CTL表位并有針對(duì)性地研制疫苗或抗體,將有望達(dá)到預(yù)防或控制輪狀病毒感染的目的而克服輪狀病毒或 NSP4疫苗的致病性,從而為通過(guò)免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生或改善膽道閉鎖的預(yù)后奠定基礎(chǔ)。

2、
　　第一部分
　　整聯(lián)蛋白α2β1在輪狀病毒致肝外膽管上皮細(xì)胞損傷中的作用
　　目的:檢測(cè)肝外膽管上皮細(xì)胞整聯(lián)蛋白的表達(dá)類型并進(jìn)一步探討其在輪狀病毒致肝外膽管上皮細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外膽管進(jìn)行肝外膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)至第三天,用直接免疫熒光法檢測(cè)整聯(lián)蛋白α2、β1亞基,用間接免疫熒光法檢測(cè)α4亞基。用透射電鏡觀察輪狀病毒與肝外膽管上皮細(xì)胞的結(jié)合。然后加入相應(yīng)的整聯(lián)蛋白抗體,再加入輪

3、狀病毒,觀察各組引起的細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:用直接免疫熒光法檢測(cè)到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細(xì)胞膜表面,用間接免疫熒光法檢測(cè)到了α4亞基存在于肝外膽管上皮細(xì)胞膜表面。同時(shí)透射電鏡觀察到了輪狀病毒與肝外膽管上皮細(xì)胞的結(jié)合。加入相應(yīng)抗體阻斷整聯(lián)蛋白α2β1和α4β1后,CPE較對(duì)照組明顯減輕,而且 CPE在阻斷α2β1組較阻斷α4β1組減輕更為明顯。

4、>　　結(jié)論:肝外膽管上皮細(xì)胞表面表達(dá)整聯(lián)蛋白α2、β1和α4亞基并且整聯(lián)蛋白α2亞基的含量可能大于α4亞基的含量,整聯(lián)蛋白α2β1可以介導(dǎo)輪狀病毒感染肝外膽管上皮細(xì)胞從而引起細(xì)胞損傷。
　　第二部分
　　輪狀病毒 NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細(xì)胞損傷中的作用
　　目的:探討輪狀病毒 NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外膽管進(jìn)行肝外膽管上皮細(xì)胞

5、培養(yǎng)至第3天,用激光共聚焦方法檢測(cè)整聯(lián)蛋白α2、β1亞基及輪狀病毒 NSP4。用siRNA干擾技術(shù)沉默培養(yǎng)至第3天的肝外膽管上皮細(xì)胞的整聯(lián)蛋白α2后加入輪狀病毒,用Real Time RT-PCR方法檢測(cè)α2亞基及輪狀病毒 NSP4的messenger RNA(mRNA)含量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:用激光共聚焦方法檢測(cè)到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細(xì)胞表面;輪狀病毒 NSP4和整聯(lián)蛋白α2亞基從感染細(xì)胞向緊鄰

6、的非感染細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)散;siRNA干擾技術(shù)表明沉默整聯(lián)蛋白α2后輪狀病毒 NSP4 messenger RNA(mRNA)含量較對(duì)照組減低(P<0.05)。
　　結(jié)論:肝外膽管上皮細(xì)胞表面表達(dá)整聯(lián)蛋白α2、β1且整聯(lián)蛋白α2β1是輪狀病毒NSP4的受體并進(jìn)一步導(dǎo)致肝外膽管上皮細(xì)胞損傷。
　　第三部分
　　輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用
　　目的:探討表達(dá)純化的輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反

7、應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用。
　　方法:對(duì)出生后24小時(shí)內(nèi)的新生鼠腹腔注射表達(dá)純化的輪狀病毒NSP4,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)肝臟CD8+淋巴細(xì)胞釋放的IFN-γ,用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)CD8+淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的肝外膽管上皮細(xì)胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)肝臟淋巴細(xì)胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測(cè)小鼠外周血清IFN-γ的含量,并研究剔除CD8+淋巴細(xì)胞后肝臟淋巴細(xì)胞

8、及外周血清釋放IFN-γ的情況及肝外膽管的損傷程度。
　　結(jié)果:胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果表明NSP4免疫后肝臟C D8+淋巴細(xì)胞釋放的I F N-γ含量大于對(duì)照組( P<0.05);細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 NSP4免疫后肝臟C D8+淋巴細(xì)胞對(duì)肝外膽管上皮細(xì)的殺傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于對(duì)照組( P<0.05),且對(duì)感染了RRV的肝外膽管上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)強(qiáng)于未感染 RRV組;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)結(jié)果表明肝臟淋巴細(xì)胞釋放的I F N-γ含量大于對(duì)照組( P

9、<0.05);外周血清 ELI S A檢測(cè)結(jié)果表明 I FN-γ釋放量大于對(duì)照組( P<0.05);剔除 C D8+ T淋巴細(xì)胞后肝臟淋巴細(xì)胞及外周血清釋放的IF N-γ含量明顯降低( P<0.05)并且肝外膽管的損傷程度較阻斷前明顯減輕。
　　結(jié)論:輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的CD8+淋巴細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)在肝外膽管的損傷中具有重要作用。
　　第四部分
　　輪狀病毒NSP4表位肽的預(yù)測(cè)與研究
　　目的:研究并明確輪狀

10、病毒NSP4的CTL表位肽。
　　方法:運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并固相多肽合成輪狀病毒NSP4的CTL表位肽,對(duì)出生后24小時(shí)內(nèi)的新生鼠腹腔注射合成的NSP4表位肽及激動(dòng)劑,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)肝臟CD8+淋巴細(xì)胞釋放的IFN-γ,用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)CD8+淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的肝外膽管上皮細(xì)胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)肝臟淋巴細(xì)胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測(cè)小鼠

11、外周血清IFN-γ的含量。
　　結(jié)果:胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+釋放的IFN-γ明顯增多( P<0.05);細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+對(duì)肝外膽管上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于 NSP424-32和NSP493-110組( P<0.05),且對(duì)

12、感染了RRV的肝外膽管上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)強(qiáng)于未感染 RRV組;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟淋巴細(xì)胞釋放的I FN-γ明顯增多( P<0.05);外周血清 ELI S A檢測(cè)結(jié)果表明 NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組釋放的I FN-γ明顯增多( P<0.05)。
　　結(jié)論:NSP4157-1