前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化與化療耐藥的關系研究.pdf

1、本課題擬先在組織學水平，利用免疫組織化學技術研究NSE，P-gp，MRP1和Bcl-2在前列腺癌和良性前列腺增生癥(BPH)手術標本中的表達。再在體外培養(yǎng)雄激素非依賴的前列腺癌DtJl45細胞，加入EGF和TGF-α誘導前列腺癌細胞發(fā)生NED，并通過光鏡、電鏡觀察和檢測NSE在mRNA和蛋白水平證實。然后用不同濃度梯度的順鉑作用于誘導發(fā)生NED的和未誘導的前列腺癌細胞，并進行對比研究。以期達到明確EGF和TGF-α是否可誘導NED,以及

2、NED是否可以介導前列腺癌化療耐藥的目的。 第一章前列腺癌和BPH組織中NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2的表達 目的：探討NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2在前列腺癌和BPH中的表達情況，并且研究這四種蛋白與前列腺癌分化程度的關系，從而為后續(xù)研究打下一定基礎。 材料和方法：10例BPH標本(55-75歲，平均61.2歲)和44例前列腺癌標本(61-77歲，平均64.3歲)取自中南大學湘雅醫(yī)院泌尿外科20

3、00-2007年的手術標本存檔蠟塊，標本系10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。前列腺癌標本按照Gleason評分。前列腺癌患者術前均未接受內(nèi)分泌治療或其他治療。標本4grn厚連續(xù)切片，分別做NSE、P-gp、MRPl和Bcl-2免疫組化染色。觀察染色切片并計數(shù)10個具有代表性的高倍鏡視野中陽性細胞的數(shù)量。陽性細胞數(shù)≤5％者為陰性表達，>5％者為陽性表達。 結(jié)果：P-gp在前列腺癌和BPH組織中均無表達；NSE、MRPl和Bcl-2

4、均有表達。MRP1在兩種組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，前列腺癌中的表達高于BPH；NSE和Bcl-2的表達無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。NSE、MRPl和Bcl-2的表達均隨著前列腺癌分化程度的降低而表達增高。NSE列聯(lián)系數(shù)(P)：0.458；MRP1列聯(lián)系數(shù)(P)：0.472；Bcl-2列聯(lián)系數(shù)(P)：0.375。將前列腺癌標本按有無NSE表達分為兩組，MRPl和Bcl-2的表達有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，且在NSE

5、表達陽性的前列腺癌組織中，兩種蛋白的表達均高于表達陰性的組織。 結(jié)論： (1)前列腺癌可表達NSE、MRPl和Bcl-2，且表達陽性率與腫瘤分化程度、Gleason評分相關，即分化差者表達更高。本研究未發(fā)現(xiàn)該腫瘤有P-gp陽性表達。 (2)表達NSE的前列腺癌，有更高的MRPl和Bcl-2表達率，即該腫瘤的NED與其MDR和抗凋亡能力增強有關。 (3)BPH可表達NSE、MRPl和Bcl-2，提示NED和

6、MRPl、Bcl-2的表達參與了該疾病的發(fā)生發(fā)展。 第二章雄激素非依賴前列腺癌細胞株DU145的NED誘導及P-gp、MRPl和Bcl-2變化檢測 目的：探討DU145細胞在受.EGF和TGF-a作用后是否會促進NED，并且檢測P-gp、MRPl和Bcl-2的蛋白表達情況。 材料和方法：將DU145細胞在不同條件下培養(yǎng)三天，每日光鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。收集三天后的細胞，Western印跡雜交檢測NSE、P-gp

7、、MRPl和Bcl-2的表達情況，實時熒光半定量RT-PCR檢測NSEmRNA的表達，電鏡觀察細胞內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。 結(jié)果：(1)光鏡下觀察：2％BCS不加生長因子的培養(yǎng)環(huán)境下，每天細胞形態(tài)無明顯變化；加入10ng/ml EGF培養(yǎng)者較5ng/ml者形態(tài)學變化明顯，以第一天發(fā)生NED的細胞數(shù)最多，每天逐漸增多，至第三天時，細胞形態(tài)變化更加明顯，表現(xiàn)為胞體由原來的橢圓形向三角形、多邊形轉(zhuǎn)化，細胞伸出神經(jīng)突出樣突起；TGF-a誘導的

8、細胞數(shù)目與EGF相似，但形態(tài)學變化不如EGF明顯。加入AG825(EGFR的酪氨酸激酶抑制劑)的培養(yǎng)細胞，形態(tài)無明顯變化。 (2)Western印跡雜交結(jié)果：NSE的表達：在不加生長因子的2％BCS細胞中表達很弱，經(jīng)EGF誘導后表達明顯增強，且10ng/ml強于5ng/ml，而加入AG825拮抗EGF作用者，幾乎無NSE表達。經(jīng)TGF-a誘導后的效果與EGF相近。Bcl-2的表達：在不加生長因子的2％細胞有表達，經(jīng)EGF或TGF

9、-a誘導后表達明顯增強，加入AG825拮抗。EGF作用者表達較弱。P-gp的表達：各組細胞幾乎無表達。MRPl的表達：在不加生長因子的2％細胞有表達，經(jīng)EGF或TGF-a誘導后表達明顯增強，加入AG825拮抗EGF和TGF-a作用者幾乎無表達。 (3)實時熒光半定量RT-PCR：相對于只加入2％BCS培養(yǎng)基的而言，加入EGF 10 ng/ml和TGF-a 10 ng/ml的細胞的NSE mRNA分別增加10.7和10.1倍，提示

10、NED程度增加。而加入AG825拮抗劑者則表達分別下降81％和77％。 (4)電鏡觀察：在不加生長因子的2％BCS細胞中幾乎無神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，經(jīng)EGF和TGF-α誘導后，顆粒明顯增多，而加入AG825拮抗者，幾乎無神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。 結(jié)論： (1)EGF和TGF-α可誘導前列腺癌DU145細胞發(fā)生NED，其誘導作用可被AG825所拮抗。 (2)DU145細胞經(jīng)誘導后表達NSE、MRPl和Bcl-2增強，提示

11、抗凋亡性和耐藥性增強。 第三章 NED誘導后DU145細胞對順鉑的耐藥性研究 目的：探討NED誘導后的前列腺癌DU145細胞的順鉑耐藥性變化。 材料和方法：EGF和TGF-a誘導DUl45細胞發(fā)生NED后，取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板上。每組均加入不同濃度的順鉑(0.1，0.5，1，5，10，50，100μg/ml)。培養(yǎng)48小時后行MTT比色法檢測順鉑對各組DUl45細胞增殖的影響。同樣方法誘導后，取對

12、數(shù)生長期的不同分組DUl45細胞，加入濃度為μg/ml的順鉑，作用48小時后收集各組細胞，經(jīng)胰酶消化離心后制成細胞懸液，行流式細胞術檢測凋亡細胞百分率并行細胞周期分析。 結(jié)果：(1)順鉑可抑制DU145細胞的增殖。在各濃度點上，尤其在較高的順鉑濃度點上，經(jīng)EGF 10 ng/ml處理的細胞存活率大于EGF 5ng/ml，經(jīng)TGF-a10 ng/ml處理的細胞存活率大于TGF-a 5 ng/ml，相同濃度生長因子處理后的細胞，經(jīng)相

13、同濃度順鉑作用后細胞存活率相近。加入AG825拮抗生長因子作用者，細胞存活率明顯降低。 (2)濃度為5μg/ml的順鉑作用48小時后，經(jīng)生長因子誘導過的細胞凋亡率低，且EGF 10 ng/ml低于EGF 5 ng/ml(p<0.05)，TGF-a10ng/ml低于TGF-α5 ng/ml(p<0.05)；細胞周期也發(fā)生變化，G0/G1細胞數(shù)減少，S期和G2/M期細胞相應增多。 結(jié)論：(1)EGF和TGF-α誘導前列腺癌D