Talen介導(dǎo)的SP110基因定位整合于PRNP基因位點(diǎn)的抗結(jié)核、抗瘙癢病羊的研制.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一類危害嚴(yán)重的人畜共患病。結(jié)核病的傳播和流行對世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、公共衛(wèi)生健康有著嚴(yán)重的影響。小鼠SP110基因是一種能調(diào)節(jié)結(jié)核病先天免疫力的基因一也稱Ipr1基因（intracellular pathogenresistance1）。大量研究結(jié)果顯示小鼠SP110基因可有效抑制結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖，并且能夠控制巨噬細(xì)胞的死亡方式。羊搔癢癥是

2、朊蛋白類疾病(prion diseases)中的一種，由變異的朊蛋白(PrP)引發(fā)，具有傳染性與不可治愈性。敲除動(dòng)物內(nèi)源性的朊蛋白可抵抗朊病毒的感染，使動(dòng)物具有抗病性。
　　TALENs靶向基因敲除（敲入）技術(shù)是一種較新的分子生物學(xué)工具，能夠?qū)?dòng)植物細(xì)胞的基因組進(jìn)行高效和特異性修飾。本實(shí)驗(yàn)旨在通過TALENs基因打靶技術(shù)在山羊基因組上朊蛋白基因（PRNP）位點(diǎn)定點(diǎn)插入SP110基因，生產(chǎn)既抗結(jié)核病又抗羊瘙癢癥的雙抗轉(zhuǎn)基因山羊。主要

3、內(nèi)容有以下幾個(gè)方面:
　　1.SP110基因在羊巨噬細(xì)胞中的功能驗(yàn)證。
　　構(gòu)建以巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控SP110表達(dá)的真核表達(dá)載體pGH-SP110，同時(shí)設(shè)pCDNA3-SP110載體及pCDNA3空載體為對照，將其轉(zhuǎn)染羊肺泡巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行體外攻菌試驗(yàn)，荷菌數(shù)計(jì)數(shù)分析攻菌后巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的數(shù)量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pGH-SP110真核表達(dá)載體的羊肺泡巨噬細(xì)胞裂解后釋放的活菌數(shù)顯著低于pCDNA3空載體對照組，說明SP

4、110具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抵抗恥垢分枝桿菌生長和增殖的能力。
　　2.TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建與活性鑒定。
　　針對羊13號染色體的PRNP基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)6組特異性的TALENs，構(gòu)建了6組表達(dá)載體并將其分別轉(zhuǎn)染羊成纖維細(xì)胞以檢驗(yàn)其切割活性。利用PCR擴(kuò)增細(xì)胞基因組中TALENs靶位點(diǎn)附近序列，通過T7E1核酸內(nèi)切酶鑒定、BamHⅠ酶切鑒定及TA克隆測序分析6組TALENs載體的基因突變功能，結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的6組TALENs中，

5、TALEN-L4/R1的切割活性最高，約為35％。
　　3.靶向PRNP基因位點(diǎn)的MSR-SP110同源重組載體構(gòu)建及定位整合細(xì)胞株的獲得。
　　針對羊13號染色體的PRNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)MSR-SP110打靶載體，PCR分別擴(kuò)增出PRNP基因第三外顯子上的5'同源臂序列和3'同源臂序列，并以Puromycin為正篩選基因，DTA為負(fù)篩選基因，構(gòu)建打靶載體pT-SP110。然后將打靶載體pT-SP110與TALEN-L4/R1共轉(zhuǎn)

6、染30日齡原代山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選共獲得102個(gè)抗性細(xì)胞克隆，通過兩輪PCR對其進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果獲得了5個(gè)發(fā)生同源重組細(xì)胞克隆，該位點(diǎn)打靶效率為4.9％。
　　4.體細(xì)胞核移植制備克隆羊及其初步分析。
　　以78號定位重組細(xì)胞為核供體進(jìn)行核移植，獲得2只懷孕羊。手術(shù)分離1只懷孕65d的克隆胎兒用于分析，基因型檢測結(jié)果顯示其PRNP基因位點(diǎn)發(fā)生了同源重組（定位敲入SP110基因）;RT-PCR檢測結(jié)果顯示該克隆羊

7、朊蛋白基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)、Westernblot檢測結(jié)果顯示該克隆羊內(nèi)源性朊蛋白表達(dá)顯著減少，預(yù)期可降低對羊瘙癢病的易感性;同時(shí)，定位插入的MSR-SP110預(yù)期可啟動(dòng)巨噬細(xì)胞特異性SP110基因表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗菌功能。
　　結(jié)論:本研究通過同源重組，在羊PRNP基因位點(diǎn)定位插入了MSR-SP110表達(dá)框，同時(shí)敲除了一個(gè)PRNP等位基因、降低朊蛋白表達(dá)，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對病菌的抵抗力。本研究將會獲得既抗結(jié)核病，又抗瘙瘁癥的轉(zhuǎn)基因羊。研