Numb分子在腸粘膜屏障形成中的作用及其機制研究.pdf

1、背景&目的
　　 腸黏膜屏障包括：機械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障。腸粘膜粘液屏障是上皮細(xì)胞表面覆蓋的由粘蛋白形成的水化的凝膠樣粘液，而腸黏膜上皮屏障是腸上皮本身及其緊密連接構(gòu)成的在體內(nèi)外環(huán)境之間形成一種組織學(xué)屏障，它們都具有機械性的保護作用。Numb分子因其能夠不對稱的分布到干細(xì)胞的兩個子代細(xì)胞，并能夠通過抑制Notch信號通路而使子代細(xì)胞具有不同的“命運”而引起人們的廣泛關(guān)注。既往研究顯示Numb表達在包括乳腺，肺，睪

2、丸，唾液腺等在內(nèi)的大多數(shù)組織上，但Numb在腸上皮細(xì)胞的表達及其功能目前還沒有報道。我們預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)Numb并非表達在腸隱窩底干細(xì)胞上，而是普遍的表達在沿著隱窩-絨毛軸的所有上皮細(xì)胞上。既往研究發(fā)現(xiàn)，Numb能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，細(xì)胞遷移和細(xì)胞極性。在腸粘膜上皮細(xì)胞上，Numb是否能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細(xì)胞粘蛋白Muc2的分泌及腸粘膜屏障的形成，以及Numb能否通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間頂端連接復(fù)合體(Apicalju

3、nctional complex，AJC)的組裝而維持腸粘膜上皮細(xì)胞屏障的完整性目前還不清楚。
　　 圍繞以上問題，本研究揭示了Numb分子與Notch通路相關(guān)分子Hes1，Hath1的表達定位關(guān)系。通過干擾Numb分子的表達揭示了其在腸上皮細(xì)胞中對Notch通路的抑制作用，及其對腸上皮細(xì)胞LS174T細(xì)胞杯狀細(xì)胞表型的影響。利用Caco-2單層細(xì)胞模型，揭示了Numb在腸上皮單層細(xì)胞屏障形成中的作用，并揭示了其通過抑制肌球蛋白

4、輕鏈磷酸化及改變細(xì)胞微絲骨架的結(jié)構(gòu)影響上皮細(xì)胞屏障通透性的作用機制。
　　 方法
　　 1.采用RT-PCR和Western blot的方法檢測Numb-PRRL和Numb-PRRS在腸上皮細(xì)胞系和腸粘膜細(xì)胞的表達，免疫組織化學(xué)檢測Numb，Hes1，Hath1，Muc2在小鼠腸粘膜上皮細(xì)胞分布，揭示它們在腸粘膜上皮細(xì)胞的定位關(guān)系，并通過AB染色顯示其與杯狀細(xì)胞的定位關(guān)系。
　　 2.構(gòu)建干擾質(zhì)粒pRNAT-U6

5、.1-shRNA-Numb，轉(zhuǎn)染LS174T細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，熒光素酶質(zhì)粒pGa981-6檢測干擾Numb表達對Notch活性的影響，及其下游靶基因Hes1，Hath1表達的影響。
　　 3.MTT實驗檢測干擾Numb表達對細(xì)胞增殖的影響，RT-PCR，Western blot及免疫熒光染色檢測Numb對Muc2表達的影響，PAS染色檢測Numb對LS174T細(xì)胞粘液分泌的影響。
　　 4.RT-PCR和Wes

6、tern blot的方法檢測Numb在腸上皮細(xì)胞系Caco-2中的表達，免疫熒光染色檢測其與粘附連接分子ZO-1，E-cadherin及Par3的表達定位關(guān)系，免疫共沉淀檢測其與E-cadherin及Par3之間的相互作用。
　　 5.干擾Numb分子的表達，TEER和FITC-Dextran滲透實驗檢測Numb分子在腸單層上皮細(xì)胞屏障通透性中的作用。鈣轉(zhuǎn)換實驗和TNF-a/INF-γ刺激實驗驗證Numb在AJC組裝和維持細(xì)胞連

7、接完整中的作用。
　　 6.免疫熒光染色檢測抑制Numb表達對鈣轉(zhuǎn)換試驗前后Caco-2細(xì)胞F-actin結(jié)構(gòu)的影響，Western blot檢測在生理和病理條件下，抑制Numb表達對細(xì)胞連接相關(guān)蛋白ZO-1，Occludin，E-cadhern，β-catenin，Claudin-1，Claudin-2的表達變化，并檢測對Caco-2細(xì)胞肌球蛋白輕鏈磷酸化水平的影響。
　　 7.DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，HE

8、染色檢測結(jié)腸組織形態(tài)變化，免疫熒光染色檢測炎癥條件下Numb在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達變化。
　　 結(jié)果
　　 1.Numb_PRRL和Numb-PRRS亞型在腸上皮細(xì)胞系和腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)都有表達，Numb與Notch通路相關(guān)分子Hes1，Hath1在腸粘膜上皮細(xì)胞存在共定位關(guān)系，與Muc2和AB染色陽性的杯狀細(xì)胞也有共定位關(guān)系。
　　 2.序列測定證實pRNAT-U6.1-shRNA-Numb成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染并經(jīng)G4

9、18篩選出穩(wěn)定細(xì)胞克隆，熒光素酶質(zhì)粒pGa981-6檢測發(fā)現(xiàn)Numb能夠抑制Notch通路活性，抑制Hes1表達，促進Hath1表達。
　　 3.Numb抑制腸上皮細(xì)胞增殖；促進LS174T表達杯狀細(xì)胞分子標(biāo)志物Muc2的表達，PAS染色發(fā)現(xiàn)Numb促進LS174T細(xì)胞粘液的分泌。
　　 4.腸上皮細(xì)胞系Caco-2表達Numb，Numb與ZO-1，E-cadherin及Par3分子共定位，IP檢測發(fā)現(xiàn)Numb與E-ca

10、dherin和Par3之間存在相互作用。
　　 5.抑制Numb分子的表達能夠增加Caco-2上皮細(xì)胞屏障通透性。鈣轉(zhuǎn)換和TNF-a/INF-γ刺激實驗證實Numb在AJC組裝和維持細(xì)胞連接完整性中發(fā)揮作用。
　　 6.抑制Numb表達能夠改變鈣轉(zhuǎn)換試驗前后Caco-2細(xì)胞F-actin的結(jié)構(gòu)；Numb對正常和炎癥條件下Caco-2細(xì)胞內(nèi)ZO-1，Occludin，E-cadhern，β1-catenin，Claudin

11、-1的蛋白水平?jīng)]有影響，但能夠升高Claudin-2的水平；Numb能夠抑制Caco-2細(xì)胞肌球蛋白輕鏈磷酸化。
　　 7.HE染色發(fā)現(xiàn)DSS成功誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)，炎癥條件下Numb在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達減少，且在細(xì)胞內(nèi)分布紊亂。
　　 結(jié)論
　　 Numb能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細(xì)胞粘蛋白Muc2的表達及粘液的分泌，參與腸粘膜粘液屏障的形成；同時Numb通過抑制肌球蛋白輕鏈的磷酸化，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞