干擾乳腺癌微環(huán)境基礎(chǔ)上提高免疫治療療效的研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于腫瘤細(xì)胞自身,還與其所處的環(huán)境密切相關(guān)。早在1889年Stephen Parget就提出了“種子與土壤”的假說,用來描述腫瘤與微環(huán)境之間的關(guān)系。乳腺癌微環(huán)境是乳腺癌局部浸潤的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及所分泌的活性介質(zhì)等與乳腺癌細(xì)胞共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境。乳腺癌和微環(huán)境之間既是相互依存,相互促進(jìn),又是相互拮抗,相互斗爭的。通過一些方法改變或影響微環(huán)境內(nèi)的某些因素,在某種程度上會延緩腫瘤的進(jìn)展程度,提高患者的生存期。

2、>　　 目前,臨床上乳腺癌的治療仍以手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療為主。這些傳統(tǒng)的治療方法對于一些早中期乳腺癌患者能起到非常好的治療效果。但是,對于一些晚期伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者,卻不能很好的控制病變的發(fā)展。隨著免疫學(xué)的發(fā)展,腫瘤免疫治療在體外研究和動物實驗中均取得了顯著的治療效果,而臨床應(yīng)用目前僅限于Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗且療效欠佳。究其原因,這與微環(huán)境內(nèi)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān),而微環(huán)境內(nèi)的免疫耐受是導(dǎo)致這種情況發(fā)生的最為關(guān)鍵的因素。

3、誘導(dǎo)微環(huán)境內(nèi)免疫耐受有很多機(jī)制,其中微環(huán)境內(nèi)抑制性細(xì)胞和一些抑制性細(xì)胞因子的作用最為重要。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類具有特殊調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群,可以通過多種方式浸潤到微環(huán)境中抑制效應(yīng)淋巴細(xì)胞功能,維持抗原特異性免疫耐受。研究表明,Treg在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌等多種常見人體腫瘤中被發(fā)現(xiàn),同時觀察到腫瘤局部T細(xì)胞功能受到明顯的抑制。有的研究者通過“抑制”或“沉默”’Freg細(xì)胞的免疫抑制功能后,發(fā)現(xiàn)免疫耐受

4、狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn),腫瘤免疫治療效果得到增強(qiáng)。最初研究認(rèn)為,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞就是CD4+CD25+Treg,隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)Foxp3+特異性表達(dá)于Treg的細(xì)胞核內(nèi),是Treg發(fā)育、活化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵。因此認(rèn)為,CD4+、CD25+和Foxp3+三標(biāo)檢測更能真實反映Treg的水平。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制因子,能廣泛抑制腫瘤患者的免疫系統(tǒng)使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視功能而迅速增殖。研究表明TGF-β在前

5、列腺癌、胃癌等惡性腫瘤中呈過度表達(dá),可以由腫瘤細(xì)胞表達(dá),也可以由多種基質(zhì)細(xì)胞表達(dá),其過度表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)化、進(jìn)展,甚至也可以決定患者預(yù)后。白細(xì)胞介素-10(IL-10)是在腫瘤免疫中發(fā)揮著顯著作用的免疫抑制性細(xì)胞因子。IL-10通過抑制抗原提呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的功能促進(jìn)腫瘤生長,發(fā)揮免疫抑制作用。
　　 傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為,放療或化療之后,機(jī)體的免疫系統(tǒng)受抑,不適宜進(jìn)行免疫治療。但是,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)一定量的放療或化療可以對微

6、環(huán)境起到免疫調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而增強(qiáng)免疫治療的療效。樹突狀細(xì)胞(DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,具有強(qiáng)大的T細(xì)胞激活能力,能顯著刺激初始型T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖和活性。因此,DCs是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者,在免疫應(yīng)答中具有重要地位,以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗在腫瘤免疫治療中占有重要位置。
　　 本實驗通過檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在人乳腺癌中的表達(dá),探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展

7、及轉(zhuǎn)移中的作用;通過建立BALB/c小鼠乳腺癌模型并給予放化療干預(yù)后,根據(jù)乳腺癌微環(huán)境中Treg的表達(dá)情況,確定最佳干預(yù)方式;在干預(yù)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合樹突狀細(xì)胞(DCs)疫苗,探討其療效及不同治療方法對微環(huán)境中TGF-β和IL-10的影響。從而為臨床化放療聯(lián)合免疫治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 第一部分人乳腺癌微環(huán)境中CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10的表達(dá)及意義
　　 目的:探討CD4+CD2

8、5+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在誘導(dǎo)乳腺癌免疫耐受中的作用和可能機(jī)制。
　　 方法:選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腺體外科乳腺癌標(biāo)本40例(淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移20例,轉(zhuǎn)移20例)、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本20例,分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CD44+CD25+Foxp3+Treg,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β和IL-10在乳腺癌原發(fā)灶、癌周組織、腋窩淋巴結(jié)以及乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:乳腺癌原發(fā)灶中三指標(biāo)

9、表達(dá)程度,均較乳腺纖維腺瘤中高(P＜0.05);原發(fā)灶中表達(dá)程度,均高于癌周組織和腋窩淋巴結(jié)(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中癌周組織三項指標(biāo)表達(dá)低于腋窩淋巴結(jié)(P＜0.05),而淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中,癌周組織和腋窩淋巴結(jié)表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 第二部分化放療聯(lián)合DCs疫苗對BALB/e小鼠乳腺癌微環(huán)境中CD4+CD25+Foxp3+Treg的影響
　　 目的:觀察不同治療方法對BALB/c小鼠乳腺癌微環(huán)境中

10、CD4+CD25+Foxp3+Treg的影響及意義。
　　 方法:將96只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組24只。以4T1乳腺癌細(xì)胞株皮下接種建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接種后16天開始治療。根據(jù)治療方式不同,分為①對照組、②化療組、③放療組、④化療+放療組。其中,每組小鼠再根據(jù)處死時間的不同隨機(jī)分為2個亞組,每個亞組12只。應(yīng)用FCM測定4T1細(xì)胞接種后20、24天乳腺癌組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)

11、,根據(jù)表達(dá)程度確定一個最佳干預(yù)組。再選取48只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組24只。以4T1乳腺癌細(xì)胞株皮下接種建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接種后16天開始治療。根據(jù)治療方式不同,分為⑤DCs疫苗組、⑥化療+放療+DCs疫苗組。其中,每組小鼠再根據(jù)處死時間的不同隨機(jī)分為2個亞組,每個亞組12只。應(yīng)用FCM測定4T1細(xì)胞接種后20、24天乳腺癌組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)
　　 結(jié)果:①CD4+CD2

12、5+Foxp3+Treg在化療組、放療組和化療+放療組接種后20天均較對照組顯著下降(P＜0.05);②CD4+CD25+Foxp3+Treg在化療+放療組接種后20天又顯著低于化療組和放療組(P＜0.05);③在DCs疫苗組接種后24天顯著低于對照組和化療+放療組(P＜0.05);④在化療+放療+DCs疫苗組接種后20、24天均顯著低于對照組、放療+化療組和DCs疫苗組(P＜0.05)。
　　 第三部分化放療聯(lián)合DCs疫苗對B

13、ALB/e小鼠乳腺癌微環(huán)境中TGF-β和IL-10的影響
　　 目的:觀察不同治療方法對BALB/c小鼠乳腺癌微環(huán)境中TGF-β和IL-10的影響及意義。
　　 方法:將144只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組,每組24只。以4T1乳腺癌細(xì)胞株皮下接種建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,接種后16天開始治療。根據(jù)治療方式不同,分為①對照組、②化療組、③放療組、④化療+放療組、⑤DCs疫苗組、⑥化療+放療+DCs疫苗組。其中,每組

14、小鼠再根據(jù)處死時間的不同隨機(jī)分為2個亞組,每個亞組12只。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法測定4T1細(xì)胞接種后20、24天乳腺癌組織中TGF-β和IL-10的表達(dá)(小鼠及分組與第二部分重復(fù))。
　　 結(jié)果:①TGF-β和IL-10在化療組中表達(dá)與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);②TGF-β和IL-10在放療組接種后20天顯著低于對照組(P＜0.05);③TGF-β和IL-10在化療+放療組接種后20天顯著低于對照組及化療組(P＜0.05)

15、,但與放療組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。④TGF-β和IL-10在DCs疫苗組接種后24天顯著低于以上四組(P＜0.05);⑤TGF-β和IL-10在化療+放療+DCs疫苗組接種后20、24天均顯著低于以上五組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、CD4、CD25和Foxp3三標(biāo)流式細(xì)胞學(xué)檢測能更準(zhǔn)確的反映乳腺癌組織中Treg的水平。
　　 2、隨著腫瘤的進(jìn)展,乳腺癌組織中CD4+CD25+Foxp3+

16、Treg、TGF-β和IL-10的水平是逐漸升高的。
　　 3、CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β和IL-10在誘導(dǎo)乳腺癌微環(huán)境內(nèi)的免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。
　　 4、化放療聯(lián)合治療對于乳腺癌微環(huán)境的影響明顯優(yōu)于單純化療和單純放療?；熀头暖熤粚θ橄侔┪h(huán)境起免疫調(diào)節(jié)作用,不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫;化放療干預(yù)乳腺癌微環(huán)境基礎(chǔ)上給予DCs疫苗較單純應(yīng)用DCs疫苗能顯著增強(qiáng)其治療效果。
　　 5、乳