體外重編程人臍帶間充質(zhì)干細胞向胰腺前體細胞分化的研究.pdf

1、目的:
　　研究人臍帶間充質(zhì)干細胞(HumanUmbilicalCordMesenchymalStemcells,HuMSCs)轉(zhuǎn)染腺病毒攜帶外源基因pdx1ngn3mafa后,向胰腺前體細胞分化潛能。
　　方法:
　　1.人臍帶間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定:人臍帶華爾通膠組織塊培養(yǎng)原代huMSCs,傳代培養(yǎng),流式細胞儀檢測鑒定HuMSCs的表面標記和免疫原性標記。
　　2.腺病毒的擴增及制備:利用AD293細胞擴增腺

2、病毒,收集到的腺病毒行梯度稀釋后,進行濃度測定,儲存在-70度超低溫冰箱備用。
　　3.腺病毒攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa轉(zhuǎn)染HuMSCs及鑒定:腺病毒攜帶β細胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(pdx1、ngn3、mafa)體外轉(zhuǎn)染第三、四代人臍帶間充質(zhì)干細胞,細胞免疫熒光化學檢測腺病毒是否轉(zhuǎn)染進入HuMSCs內(nèi);CCK-8檢測轉(zhuǎn)染誘導后HuMSCs增值能力。
　　4.HuMSCs轉(zhuǎn)染攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa

3、腺病毒后向胰腺前體細胞分化的鑒定:轉(zhuǎn)染腺病毒后倒置相差顯微鏡下觀察誘導后細胞形態(tài)學變化,RT-PCR和熒光定量PCR對誘導細胞進行相關(guān)基因(glucagon、pdx1、nkx2.2)鑒定。應(yīng)用2-ΔΔCT比較各組在不同誘導方式,不同時間內(nèi)源性基因水平。
　　結(jié)果:
　　1.臍帶間充質(zhì)(華爾通膠)組織塊原代培養(yǎng)7天,貼壁組織塊周圍有細胞爬出,呈成纖維様細胞。流式細胞儀檢測第三至第五代的HuMSCs表面標記,Oct4(45.2％

4、)、CD29(89.64%)、CD59(91.19%)、CD80(0.11%)、CD86(0.08%)、CD40(0.03%)、CD40L(0.07%),
　　2.腺病毒攜帶三種基因單獨或者是聯(lián)合轉(zhuǎn)染HuMSCs后,熒光顯微鏡下觀察腺病毒已進入細胞內(nèi);CCK-8檢測細胞增值顯示,在感染復數(shù)(MOI)為50的情況下,腺病毒進入細胞內(nèi)細胞增殖組間無差異。
　　3.倒置相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的HuMSCs細胞培養(yǎng)三天或者七天細胞形

5、態(tài)未見明顯變化;RT-PCR檢測到基因glucogon(GCG),neuroD1,測序匹配率分別為93.21%,93.91%;熒光定量PCR顯示轉(zhuǎn)染誘導后HuMSCs表達人源性胰腺前體細胞相關(guān)基因glucagon(GCG)、pdx1、nkx2.2基因;
　　3.1.GCG基因誘導表達:HuMSCs第三天即有三種基因聯(lián)合誘導3天和7天時最高(均為21倍),7天時GCG基因表達水平與三天相比較無明顯差別;mafa與ngn3兩個基因聯(lián)合

6、誘導水平次之三天14倍、七天15倍,mafa在內(nèi)源性GCG基因產(chǎn)生過稱中起到關(guān)鍵作用。
　　3.2.pdx1基因誘導表達:在3種基因共同聯(lián)合誘導培養(yǎng)三天時最高(15倍),mafa單獨作用轉(zhuǎn)染誘導pdx1基因表達水平可提高6倍,與pdx1或者是ngn3聯(lián)合作用時并不能促進pdx1基因表達水平;誘導七天時mafa與ngn3協(xié)同作用pdx1基因表達水平最高5倍,ngn3單獨誘導次之;對轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)七天與三天pdx1基因水平進行比較,三種基

7、因聯(lián)合誘導作用條件下pdx1基因無提高,而pdx1單獨誘導培養(yǎng)7天可提高7倍,對于內(nèi)源性pdx1基因誘導能力最強,隨著培養(yǎng)時間延長,基因表達水平升高。
　　3.3.nkx2.2基因誘導表達:在ngn3單獨誘導培養(yǎng)三天時最高(8倍),mafa與ngn3聯(lián)合誘導次之(4.5倍);誘導培養(yǎng)7天時pdx1和mafa聯(lián)合轉(zhuǎn)染誘導nkx2.2水平無提高、pdx1和ngn3聯(lián)合(2.5倍),其他組pdx1、ngn3、mafa、ngn3與mafa

8、聯(lián)合、三種基因共同作用時轉(zhuǎn)染誘導nkx2.2基因水平差別無意義2倍。誘導后培養(yǎng)3天和7天時nkx2.2基因水平比較結(jié)果為:除ngn3單獨作用和mafa與ngn3聯(lián)合時nkx2.2基因水平無提高外,ngn3對于內(nèi)源性nkx2.2基因誘導作用在培養(yǎng)至第三天時達到最高水平,隨培養(yǎng)時間延長時間而出現(xiàn)抑制作用,其他組均較3天時提高,pdx1可提高nkx2.2水平為11倍,Pdx1單獨作用時對于內(nèi)源性nkx2.2基因誘導能力最強,隨著培養(yǎng)時間延長,

9、基因表達水平升高。
　　結(jié)論:
　　腺病毒攜帶胰島β細胞發(fā)育的三個關(guān)鍵基因pdx1、ngn3、mafa單獨或者是聯(lián)合轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞,誘導胰腺早期基因GCG、pdx1、nkx2.2、neuroD1表達。不同外源性基因?qū)μ囟ɑ虍a(chǎn)生過稱中起到關(guān)鍵作用,并且在內(nèi)源性基因產(chǎn)生過程存在時間差異性和組合內(nèi)基因的拮抗作用,當基因表達量達到一定程度,不會隨培養(yǎng)時間延長而增加,有待做進一步的研究,探索最佳基因誘導時間及組合方式。該發(fā)現(xiàn)