同一等位基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的I型遺傳性抗凝血酶缺陷癥.pdf

1、目的：①對一例反復(fù)發(fā)作靜脈血栓患者進行表型研究及家系調(diào)查。②對該患者及家系成員的AT基因進行測序分析，尋找致病突變，并對其分子發(fā)病機制進行初步研究。
　　 方法：⑴采用免疫比濁法和發(fā)色底物法分別檢測先證者及其家系成員的AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A）。⑵提取患者及其家系成員外周血基因組DNA， PCR擴增AT基因（SERPINC1）7個外顯子及其側(cè)翼序列，利用直接測序法對先證者進行AT基因序列分析。針對先證者中發(fā)現(xiàn)的

2、突變位點，對其家系成員進行相應(yīng)基因突變檢測，同時在100例正常人中篩查以排除多態(tài)性。⑶以正常pcDNA3.1（-）/ATcDNA質(zhì)粒為模板，利用定點突變技術(shù)構(gòu)建AT突變體表達質(zhì)粒。 將正常pcDNA3.1（-）/ATcDNA質(zhì)粒以及AT突變體表達質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染COS7細胞并進行培養(yǎng)。收集COS7細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液， 使用ELISA方法檢測AT：Ag。
　　 結(jié)果：①先證者AT：Ag和AT：A分別為114mg/L和54.

3、8％，其AT基因外顯子2區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個雜合點突變，分別為c.134G>A和c.342T>G，其家系部分成員檢測到相應(yīng)的雜合突變，TA克隆證實 2個雜合突變位于同一等位基因。②以正常pcDNA3.1（-）/ATcDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)液和細胞裂解液的AT：Ag為100％，則ATM1，ATM2和ATM3（分別對應(yīng)c.134G>A，c.342T>G和雙突變）細胞培養(yǎng)上清液AT：Ag分別為25.3 ％， 35.3％，30.3 ％，而細胞裂解液AT