ART操作對雄性小鼠睪丸組織基因表達和脂類代謝影響及其機理研究.pdf

1、第一部分 ART小鼠睪丸組織基因表達改變及跨代傳遞研究
　　 已有的研究報告表明通過卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)等輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)出生的男性后代，存在生殖道畸形發(fā)生率增加、精液質(zhì)量下降和生殖功能相關(guān)基因表達異常等改變。然而由于遺傳背景和生活環(huán)境的差異、加上倫理法律的限制，利用人類臨床資料很難明

2、確各項ART操作對男性生殖健康的影響。故此我們利用近交系小鼠，分別建立控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）、體外受精（in vitro fertilization and embryo-transfer, IVF-ET）和ICSI動物模型，對新生ART小鼠睪丸組織的基因的表達做進一步分析。
　　 首先以自然出生小鼠為對照，應(yīng)用表達芯片對通過ICSI受精出生的新生小鼠睪丸

3、組織基因表達譜進行了分析。在芯片篩出的差異基因中，聚焦與男性生殖健康相關(guān)的8個非印記基因(Dmc1、Prok2、Rec8、Rhox5、Spo11、 Adcyap1r1、Amh和Pdgfra)及6個父源表達的印記基因(Igf2、Kcnq1ot1、Mest、Peg3、Plagl1和Snrpn)，應(yīng)用RT-PCR檢測這些基因在COH、IVF、ICSI出生成年小鼠（F1代），及其與自然出生小鼠交配出生的ART F2代小鼠睪丸組織中的表達;利用焦

4、磷酸測序等檢測F1代和-F2代小鼠睪丸中印記基因差異甲基化區(qū)域的甲基化修飾狀態(tài)。
　　 結(jié)果顯示:(1)對于ICSI新生小鼠中表達下調(diào)的男性生殖健康相關(guān)的8個非印記基因，其差異可持續(xù)到成年F1代小鼠，而在新生鼠中表達上調(diào)的基因在成年到恢復(fù)正常的表達水平。6個父源表達的印記基因中印記基因Kcnq1ot1、Mest、Peg3、Plagl1和Snrpn在ICSI成年F1代小鼠睪丸組織中表現(xiàn)出低表達和高甲基化。IVF成年小鼠的基因表達和

5、甲基修飾改變與ICSI類似。(2)自然妊娠、COH、IVF和ICSI F1代小鼠之間還進行兩兩比較，分析不同ART處理對子代睪丸基因表達的影響，結(jié)果顯示超促排卵、體外胚胎和ICSI機械刺激在不同程度上都可以影響睪丸基因表達水平。其中體外培養(yǎng)和機械刺激是造成父源印記基因表達下調(diào)的主要原因。對于非印記基因的表達下調(diào)，三個因素具有累加效應(yīng)。(3) ICSI和IVF F1代小鼠中存在的印記基因表達和修飾改變，多數(shù)在F2代小鼠的睪丸組織中仍然可見

6、。ART F1代存在的非印記基因表達改變多數(shù)在ICSI F2代仍可見，然而在IVF F2中已恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論:ICSI操作引起的小鼠睪丸基因表達改變，部分可延續(xù)到成年小鼠，其中成年小鼠睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞的基因表達改變可能更為明顯。超促排卵、體外培養(yǎng)和ICSI機械刺激等ART操作可在不同程度上影響出生小鼠睪丸基因表達。ART操作引起的小鼠睪丸基因表達改變機理涉及基因甲基化表觀遺傳修飾，并且睪丸基因表達和甲基化修飾改變可跨代傳

7、遞，尤以ICSI為著。
　　 第二部分 ART雄性小鼠脂肪酸代謝的變化及機理研究
　　 作為三大代謝之一，脂類代謝在宮內(nèi)胎兒生長發(fā)育中作用重要。大量臨床研究指出行輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)出生子代存在出生體重異常的現(xiàn)象，同時對ART受孕分娩胎盤的觀察表明，此類妊娠易發(fā)胎盤形狀和重量異常，可能影響胎盤脂類代謝，限制母嬰間甾類激素的傳遞，改變胎兒正常的脂類代謝過程

8、。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ART新生雄性小鼠存在出生高體重，因此在第二部分繼續(xù)探討ART男性子代的健康狀況，并將重點放在ART雄性后代脂肪酸代謝上。此外，在這部分中還將就ART小鼠脂肪酸代謝改變的機理做初步探索。
　　 首先利用已建立的控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、體外受精（in vitro fertilization and embryo-transfer, IV

9、F-ET）和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)小鼠模型，對出生成年和老年雄性小鼠肝臟和脂肪組織中的脂肪酸組成、脂肪酸合成和分解代謝酶類相關(guān)基因進行了檢測，并通過脂肪酸組成相關(guān)性分析探討脂肪酸代謝相關(guān)酶的活性對脂肪酸組成的影響。其次，用兩個劑量的促性腺激素對小鼠進行超排處理，檢測胚胎的得率、脂類的分布和含量、脂肪酸組成以及甘油三脂代謝相關(guān)酶類的表達。同時檢測促排組血清孕酮及卵巢

10、膽固醇含量，分析其對胚胎脂代謝變化的影響。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)與對照組-自然妊娠出生小鼠相比，三類ART小鼠的脂肪組織和肝臟組織的脂肪酸組成差異明顯。各ART成年小鼠脂肪組織SFAs和MUFAs含量增加，PUFAs含量減少，而三類ART成年小鼠肝臟組織脂肪酸組成變化不盡相同。并且上述差異隨小鼠年齡增加而改變。(2)脂肪酸代謝相關(guān)酶的活性和表達不僅在各組之間發(fā)生變化，而且隨年齡的增長也有所改變。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝相關(guān)

11、酶可能是通過調(diào)節(jié)肝臟中C16∶0和脂肪組織中C18∶0的含量影響脂肪酸的組成。在脂肪組織中無論是成年還是老年三個ART組中脂肪酸合成相關(guān)基因的表達水平變化都是一致的，而且脂肪酸合成相關(guān)基因的表達在自然妊娠組隨年齡增長而增加，在三個ART組隨年齡增長而降低。(3)胚胎中出現(xiàn)促性腺激素依賴性的脂類聚集、脂肪酸合成下降以及激素劑量依賴性的脂肪酸組成的改變。
　　 結(jié)論:ART過程可改變成年雄性小鼠脂肪和肝臟組織的多種脂肪酸含量，影響相