膽道閉鎖血清早期標志蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、膽道閉鎖在亞洲國家的發(fā)病率較高，早期診斷及及時手術(shù)治療是影響預后的關(guān)鍵因素之一；60日齡前手術(shù)，術(shù)后膽汁流的恢復率、黃疸的消退程度及術(shù)后10年生存率(未肝移植)明顯高于90日齡后手術(shù)的患兒。目前我們臨床針對膽道閉鎖的早期診斷方法，包括觀察大便顏色、肝膽同位素檢查、腹部肝膽B(tài)超、腹部CT/MRI、肝穿刺活檢等，這些檢查各有其優(yōu)缺點，特異度和敏感度均待提高，明確診斷仍依賴剖腹探查，術(shù)中膽道造影。因此，急需研究及發(fā)現(xiàn)早期診斷的無創(chuàng)性生物學標志

2、物。本研究利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，比較了膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達譜的差異，目的在于發(fā)現(xiàn)并驗證差異表達蛋白，為尋找膽道閉鎖早期診斷生物學標志物奠定基礎(chǔ)。首先利用蛋白質(zhì)組學的表面加強激光解離-飛行時間-質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization，time offlight，mass spectroscopy，SELDI-TOF-MS)，采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片為檢測介質(zhì)，得

3、到蛋白質(zhì)指紋圖譜，在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0214)；第二部分，運用傳統(tǒng)的雙向電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF-MS/MS)，該技術(shù)上和SELDI-TO

4、F-MS互補，比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)'SP40，40’、載脂蛋白A-Ⅳ、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、α-1-B糖蛋白等在膽道閉鎖組患兒中高表達，afamin前體在淤膽型嬰兒肝炎組中高表達；免疫印跡技術(shù)證實差異蛋白‘Sp40，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達。本研究發(fā)現(xiàn)和證實了‘Sp40，40’在兩組患兒血清中表達的差異，提示‘Sp40，40’可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在

5、血清標記物。
　　 第一部分、蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選膽道閉鎖早期診斷的血清生物標志物
　　 本部分的研究采用蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，該技術(shù)能檢測到的蛋白峰一般分子量都在2000—30000Da以內(nèi)，可與雙向電泳(主要研究大分子量蛋白)形成技術(shù)上互補，具有快速、操作簡便、樣品用量少和對多樣品的平行檢測等特點，各種樣品可以經(jīng)過簡單的預處理后

6、直接地加到表面經(jīng)過特殊修飾的芯片上。
　　 入選患兒分兩組，均為出生后30—60日齡的小嬰兒，均有明顯的黃疸，血清結(jié)合膽紅素水平明顯升高；第1組為經(jīng)外科術(shù)中膽道造影明確膽道閉鎖患兒21例，為膽道閉鎖組；第2組經(jīng)同位素肝膽顯像或剖腹探查膽道造影示膽道通暢或經(jīng)過長期隨訪后黃疸消退，證實非膽道閉鎖患兒21例，為淤膽型嬰兒肝炎組，將其設(shè)為對照組。收集這兩組患兒的血清，采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片為檢測介質(zhì)，經(jīng)表面加強激光解離-飛行時間-質(zhì)

7、譜(SELDI-TOF-MS)測定，得到蛋白質(zhì)指紋圖譜，并運用BioMarker Wizard軟件分析比較；在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，檢測出的25個蛋白峰中，強度變異系數(shù)15％，比較膽道閉鎖與淤膽型嬰兒肝炎患兒之間的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0214)，提示可能是膽道閉鎖早期診斷的蛋白質(zhì)分子標志。
　　 第二部分、雙向電泳-質(zhì)譜技

8、術(shù)篩選膽道閉鎖早期診斷的血清生物學標志物
　　 本部分研究在第一部分研究的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)的雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜，進一步比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)分子。2-DE技術(shù)作為經(jīng)典的蛋白質(zhì)組技術(shù)，具有可以進行蛋白質(zhì)相對定量的比較，以及在同張膠上顯示同型異構(gòu)蛋白等優(yōu)勢，是蛋白質(zhì)組研究常用的方法；蛋

9、白質(zhì)首先根據(jù)等電點的不同，在一向等電聚焦電泳中分離，接著轉(zhuǎn)移到二向SDS-PAGE凝膠上，根據(jù)相對分子量大小的不同被分離。已有許多研究通過2-DE技術(shù)分離血清蛋白質(zhì)組學，并進行疾病相關(guān)研究。
　　 入選患幾分兩組，各12例，入選條件同第一部分，設(shè)膽道閉鎖患兒為病例組，淤膽型嬰兒肝炎患兒為對照組；采集這兩組患兒的血清，同組內(nèi)樣品等體積混合后，采用安捷倫公司的High Capacity Multiple Affinity Remov

10、al System for theDepletion of High-Abundant Proteins from Human Proteomic Samples試劑盒，有效去除血清6種高豐度蛋白，在同等蛋白質(zhì)上樣量的條件下，參考膠圖譜點數(shù)可至2000多個點；進行雙向凝膠電泳，每組均跑3塊膠，Imagemaster2D6.0凝膠圖像軟件分析兩組患兒血清蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)17個異點，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對差異點進行鑒定，通過數(shù)據(jù)

11、庫搜索，去冗余后共鑒定10個蛋白；發(fā)現(xiàn)'SP40，40’、載脂蛋白A-Ⅳ、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、α-1-B糖蛋白等在膽道閉鎖組患兒中高表達，afamin前體在淤膽型嬰兒肝炎組中高表達。免疫印跡證實差異蛋白‘Sp40，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達；‘Sp40，40’的初步驗證結(jié)果提示可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在血清標記物。雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)可發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，從而為

12、膽道閉鎖的早期診斷及治療奠定基礎(chǔ)；結(jié)合適當?shù)难鍢悠奉A處理，該技術(shù)可以成為篩選疾病相關(guān)血清標記物的有力工具。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究利用了兩種相對穩(wěn)定、標準的血清蛋白質(zhì)組學技術(shù)平臺：一種是快速、高通量的SELDI-TOF-MS分析；另一種是2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析；兩種蛋白質(zhì)組學技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)早期膽道閉鎖患兒和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達譜確實存在差異。
　　 2.應用SELDI-

13、TOF-MS分析，在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，檢測出的25個蛋白峰中，比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0214)。
　　 3.應用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析，在有效去除血清高豐度蛋白的前提下，發(fā)現(xiàn)了兩組患兒血清蛋白質(zhì)譜存在17個差異點，鑒定為10種蛋白質(zhì)，其中免疫印跡證實差異蛋白‘Sp4

14、0，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達；‘Sp40，40’的初步驗證結(jié)果提示可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在血清標記物。
　　 潛在應用價值：
　　 1.2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)了兩組患兒血清表達譜中存在10種差異蛋白，免疫印跡證實差異蛋白‘Sp40，40’表達存在差異；發(fā)現(xiàn)的差異蛋白有可能成為膽道閉鎖早期診斷的標志物及早期干預的指標，豐富了膽道閉鎖早期診斷指標的選擇和組