CDC25A和TGF-β-Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在食管癌中的表達(dá)及其在青蒿琥酯抗食管癌中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：食管癌(esophageal carcinorna，EC)是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國是 EC 高發(fā)區(qū)，發(fā)病率僅次于胃癌而居消化道腫瘤發(fā)病率第二位，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。因此，探討 EC 的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點及有效的治療藥物，對降低EC的死亡率，延長患者的壽命，將有十分重要的意義。 目前普遍認(rèn)為細(xì)胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。細(xì)胞分裂周期25 (cell division cycle

2、 25，CDC25)雙特異磷酸酯酶作為細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子，其與腫瘤的關(guān)系倍受關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)人類共有三種CDC25同型異構(gòu)體——CDC25A、CDC25B和CDC25C，其中CDC25A可通過去除位于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK) ATP結(jié)合位點上蘇氨酸、酪氨酸殘基抑制性磷酸化而活化CDK，使其與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合，這一過程是細(xì)胞由G<,1>期進(jìn)入S期及由G2期進(jìn)

3、入M期所必需的。已有研究證實，CDC25A在多種腫瘤組織中均有過度表達(dá)，這為解釋腫瘤細(xì)胞周期紊亂、生長旺盛、過度增殖提供了證據(jù)。因此，CDC25A可能是一些調(diào)控細(xì)胞周期的抗腫瘤藥物的新靶點。 青蒿琥酯(artesunace，ART)是半合成的青蒿素(artemisinin)的衍生物。最近研究表明，ART 除了具有經(jīng)典抗瘧活性以外，還可通過調(diào)控細(xì)胞周期對人體多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑瘤作用，但ART是否可通過調(diào)控細(xì)胞周期而對人食管癌發(fā)揮抑

4、瘤作用，其調(diào)控細(xì)胞周期是否與CDC25A有關(guān)尚不十分清楚。 人體內(nèi)CDC25A的表達(dá)水平主要通過泛素依賴的蛋白酶體降解途徑加以調(diào)控。以往的證據(jù)顯示，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)靶蛋白的泛素化，進(jìn)而加速靶蛋白的降解。而Smad3則是這一過程的限速因子。但TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與CDC25A 的表達(dá)調(diào)控尚不清楚。最新的研究顯示，多種腫

5、瘤細(xì)胞系高表達(dá)CDC25A是由于泛素依賴的蛋白酶體降解途徑的功能異常，同時伴有TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)異常，提示TGF-β/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能通過調(diào)節(jié)泛素依賴的蛋白酶體降解途徑而影響CDC25A的表達(dá)水平。ART是否可通過TGF-β/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)CDC25A的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程尚不清楚。為此，本研究擬探討CDC25A及TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在食管上皮癌變過程中的表達(dá)情況及其與

6、臨床病理特征的關(guān)系；分析ART對人食管癌Eca-109 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及CDC25A、TGF-β和Smad3表達(dá)的影響及其對健康成年人外周血單個核細(xì)胞(human peripheral bloodmononuclear cell，hPBMC)增殖活性的影響，并進(jìn)一步應(yīng)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)沉默Smad3，探討TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與CDC25A表達(dá)及ART周期阻滯作用之間的關(guān)系

7、，以期揭示ART誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。此外，本研究還將探討ART對裸鼠食管癌移植瘤模型的增殖、細(xì)胞周期以及CDC25A 和Smad3表達(dá)的影響，為將ART應(yīng)用于人食管癌治療提供新的理論和實驗依據(jù)。 方法 1 食管上皮癌變過程中CDC25A、TGF-β和Smad3 蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系收集食管癌手術(shù)切除標(biāo)本52例，每例標(biāo)本分別取癌組織、癌旁組織(距癌邊緣2cm)及手術(shù)切緣正常食管粘膜(距癌邊緣

8、5cm以上)，經(jīng)病理組織學(xué)診斷證實，其中正常食管粘膜上皮24例，非典型增生組織25例(輕度非典型增生23例，中重度非典型增生2例)，浸潤性食管鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)組織52例(高分化SCC 21例，中低分化SCC 31例)。采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測CDC25A、TGF-β及Smad3的表達(dá)情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran

9、scription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測40例術(shù)中收集的新鮮食管癌、同個體癌旁食管粘膜和手術(shù)切緣正常食管粘膜組織中CDC25A的mRNA表達(dá)，分析CDC25A、TGF-β和Smad3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。 2 ART 對人食管癌Eca-109細(xì)胞和hPBMC的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及機(jī)制常規(guī)培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞。以不同濃度的ART(1、10、100μmol/

10、L)分別作用于Eca-109細(xì)胞24、48、72h，采用MTT法觀察ART對Eca-109細(xì)胞生長的影響；常規(guī)分離培養(yǎng)hPBMC，同時加入ConA(10μg/ml)以及不同濃度ART(1、10、1 00μmol/L)，培養(yǎng)24、48、72h，采用MTT法觀察ART對hPBMC增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞周期分布；半定量RT-PCR方法檢測CDC25A、TGF-β及Smad3 mRNA表達(dá)的變化；

11、Western blot檢測CDC25A、TGF-β及Smad3蛋白表達(dá)的變化。進(jìn)一步以RNAi沉默Eca-109細(xì)胞的Smad3，由武漢晶賽公司根據(jù)人Smad3基因序列轉(zhuǎn)錄RNA的位置及小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)設(shè)計原則，設(shè)計了2個靶位點，并據(jù)此構(gòu)建了2個針對靶位點的載體編碼小發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)的質(zhì)粒表達(dá)載體(S1和S2)，同時合成了一個陰性對照

12、質(zhì)粒表達(dá)載體(HK)。這些載體能表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)和具有新霉素(neomycin，neo)抗性。采用陽離子脂質(zhì)體將它們轉(zhuǎn)染入人食管癌Eca-109細(xì)胞；FCM觀察轉(zhuǎn)染效率，選擇出陽離子脂質(zhì)體和質(zhì)粒表達(dá)載體最合適的比例；在轉(zhuǎn)染48h后，分別采用RT-PCR和Western blot方法觀察Eca-109細(xì)胞Smad3mRNA 和蛋白沉默效果，篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體，用

13、于后續(xù)實驗。將干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后加入ART 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖；采用RT-PCR和FCM方法檢測CDC25A mRNA和蛋白表達(dá)隨時間變化規(guī)律；采用FCM檢測細(xì)胞周期分布，分析TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ART誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞周期阻滯中的作用。 3 ART對人食管癌裸鼠移植瘤生長的影響及其機(jī)制研究將人食管癌Eca-109細(xì)胞接種于30只BALB/c nu/nu裸鼠(

14、4周齡，雌雄各半，18～20g)左前肢皮下(6×10<'6>/200μl/只)，構(gòu)建食管癌裸鼠移植瘤模型。30只裸鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組(每組6只)。接種后第7天，實驗組分別給予100、200、300 mg/kg ART，腹腔注射，連用7d，停藥一周，再繼續(xù)連用7d；陽性對照組給予3mg/kg順鉑(DDP)，腹腔注射，連用7d；陰性對照組給予生理鹽水代替ART。實驗過程中每隔3d測量一次裸鼠的體重及腫瘤的長、短徑，計算腫瘤體積=長徑×

15、短徑<'2>/2，繪制腫瘤生長曲線。ART停藥一天后采用拉頸法統(tǒng)一無痛苦處死裸鼠，取瘤塊稱重。FCM檢測移植瘤細(xì)胞周期變化，RT-PCR、IHC法檢測CDC25AmRNA和蛋白表達(dá)，F(xiàn)CM法檢測Smad3蛋白表達(dá)變化。 結(jié)論 1 在食管上皮的癌變過程中，SCC的CDC25A蛋白的表達(dá)顯著高于正常上皮及非典型增生組織，而后二者CDC25A蛋白的表達(dá)無顯著性差異。CDC25A過表達(dá)參與SCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，提示CDC25A在食

16、管癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，選擇性抑制CDC25A表達(dá)可能成為防治食管癌的有效途徑之一。 2 首次對食管癌上皮癌變過程中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成員Smad3表達(dá)水平進(jìn)行分析。Smad3 蛋白表達(dá)水平在浸潤性SCC組顯著低于非典型增生組織和正常組織，而后二者Smad3 蛋白的表達(dá)無顯著性差異。Smad3與CDC25A的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者的異常表達(dá)共同參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程，增加Smad3的表達(dá)有可能是抑制CDC25

17、A表達(dá)的有效方法。 3 ART 能在體外抑制食管癌：Eca-109細(xì)胞增殖，但對hPBMC增殖影響較小，提示其對人體免疫功能影響較小。其抑瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞G<,0>/G<,1>期及G<,2>/M 期阻滯有關(guān)。 4 本實驗首次證實ART能在體內(nèi)抑制人食管癌裸鼠皮下移植瘤的生長，且無明顯的毒副作用，為將ART應(yīng)用于食管癌的治療提供了實驗依據(jù)。 5 ART可在體內(nèi)外下調(diào)食管癌Eca-109 細(xì)胞CDC