青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過(guò)程中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變化的研究.pdf

1、研究背景與目的： 綜上所述，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面TfR1表達(dá)增多，使通過(guò)TfR1途徑內(nèi)流的鐵多于正常細(xì)胞，提示鐵可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。與鐵內(nèi)流和外流相關(guān)的蛋白DMT1、FPN1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)是如何變化的，經(jīng)PubMed檢索，目前僅有的四篇文獻(xiàn)報(bào)道的都是實(shí)體瘤。沒(méi)有有關(guān)白血病方面的報(bào)道。雖然青蒿素在體內(nèi)體外的抗癌作用已被廣泛報(bào)道，實(shí)驗(yàn)表明鐵與青蒿琥酯在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)也有協(xié)同作用，但是作用的分子機(jī)理尚不清楚，青蒿素及其衍生

2、物與鐵的作用位點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究，青蒿素是否影響腫瘤細(xì)胞與鐵內(nèi)流和外流相關(guān)的蛋白TfRl、DMT1、FPN1也未見(jiàn)報(bào)道。青蒿素作用于耐藥細(xì)胞能否通過(guò)影響TfR1、DMT1、FPN1的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)耐藥也未見(jiàn)報(bào)道。 本課題擬研究： ①CML-CP和CML-BC患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的TfR1、DMT1、FPN1在mRNA水平和TfR1(CD71)在蛋白水平的表達(dá)以及血清鐵蛋白的變化。 ②以K562細(xì)胞作為體外研究CML的細(xì)胞

3、模型，探討青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時(shí)TfR1、DMT1、FPN1在mRNA和TfR1(CD71)、DMT1在蛋白水平的表達(dá)變化。并以DFO為對(duì)照，研究二者對(duì)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白影響的異同。 ③以耐伊馬替尼的K562細(xì)胞(K562resistance，K562-R)作為體外研究CML耐藥的細(xì)胞模型，探討青蒿琥酯能否誘導(dǎo)K562-R細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步探討對(duì)K562-R細(xì)胞的TfR1、DMT1、FPN1在mRNA和TfR1(CD71)、DM

4、T1在蛋白水平的表達(dá)變化。為尋找新的治療CML的靶向藥物提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.2006～2007年在南方醫(yī)院血液科門(mén)診或住院治療的CML患者共13例，其中CML-CP8例，CML-BC5例。3例非惡性腫瘤患者作為正常對(duì)照。用放射免疫法測(cè)定血清鐵蛋白值，用半定量RT-PCR的方法分析患者和對(duì)照骨髓標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞中TfR1mRNA、DMT1mRNA和FPN1mRNA的表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀測(cè)TfR1(CD71)在蛋白

5、水平的表達(dá)。 2.用MTT法檢測(cè)青蒿琥酯抑制K562細(xì)胞增殖作用。設(shè)青蒿琥酯終濃度分別為：4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L三個(gè)組，并設(shè)24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。并用此三個(gè)濃度以48h和72h二個(gè)時(shí)間段用hnnexinV-PI雙染和Hochest33258染色檢測(cè)凋亡。以K562細(xì)胞未處理組為空白對(duì)照，用半定量RT-PCR方法檢測(cè)上述三個(gè)濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細(xì)

6、胞48h后TfR1、DMT1和FPN1mRNA表達(dá)的變化：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三個(gè)濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細(xì)胞48h后TfR1蛋白(CD71)表達(dá)的變化，并用westernblot法檢測(cè)2×10-4mol/L青蒿琥酯處理K562細(xì)胞48h后DMT1蛋白的表達(dá)。 3.用MTT法檢測(cè)青蒿琥酯抑制K562-R細(xì)胞增殖作用。設(shè)青蒿琥酯終濃度分別為4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L三個(gè)組，設(shè)作

7、用時(shí)間48h進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，AnnexinV-PI雙染后以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。以K562-R細(xì)胞未處理組為空白對(duì)照，用半定量RT-PCR方法檢測(cè)三個(gè)濃度的青蒿琥酯處理K562-R細(xì)胞48h后TfR1、DMT1和FPN1mRNA表達(dá)的變化；用流式細(xì)胞儀檢NTfR1蛋白(CD71)表達(dá)的變化，并用westernblot法檢測(cè)2×10-4mol/L青蒿琥酯處理K562-R細(xì)胞48h后DMT1蛋白的表達(dá)。 4.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS11.

8、5統(tǒng)計(jì)軟件，以AONEWAYANOVA，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)和單樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。 研究結(jié)果： 1.CML-CP和BC期的血清鐵蛋白值都高于對(duì)照組，但僅CML-BC與對(duì)照組有顯著性差異(P=0.020)。CML-CP和BC期TfR1mRNA、DMT1mRNA和FPN1mRNA都比對(duì)照組高，且與對(duì)照組比較有顯著性差異(TfR1mRNA：P=0.000，P=0.000；+IRE-DMT1mRNA：P=0

9、.000，P=0.000；FPN1mRNAP=0.029，P=0.003)。CML-CP和BC期之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。CML-CP和BC期CDT1都比對(duì)照組高，CML-BC期與對(duì)照組比較有顯著性差異(P=0.034)，CML-CP與對(duì)照組以及CML-CP和BC期之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2.4×10-5mol/L、2×10-4mol/L與10-3mol/L青蒿琥酯處理K562細(xì)胞24h、48h和72h時(shí)，各

10、濃度組的細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較，都有顯著性差異(P<0.05)。組間比較顯示：24h組2×10-4mol/L與10-3mol/L的細(xì)胞抑制率比較，P=0.005：48h組相鄰濃度的組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.05)。72h組相鄰濃度組間比較顯示：僅2×10-4mol/L與10-3mol/L的細(xì)胞抑制率之間有顯著性差異(P=0.001)。AnnexinV-PI雙染檢測(cè)顯示：4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3m

11、ol/L青蒿琥酯處理K562細(xì)胞48h，72h，細(xì)胞總凋亡率呈時(shí)間和濃度依賴性。多重組間比較顯示：48h和72h組中，三個(gè)濃度的組間凋亡率有顯著性差異(P<0.01)。用半定量RT-PCR方法檢測(cè)低、中、高濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細(xì)胞48h后，青蒿琥酯使K562細(xì)胞表面的TfR1mRNA表達(dá)比對(duì)照組減少(P=0.014，0.000，0.000)，且呈濃度依賴性。去鐵敏使K562細(xì)胞表面的TfR1mRNA表達(dá)比對(duì)照組增加

12、(P=0.015)。低濃度青蒿琥酯使K562細(xì)胞+IRE-DMT1mRNA表達(dá)降低，中高濃度使其不表達(dá)。 3.4×10-5mol/L、2×10-4mol/L與10-3mol/L青蒿琥酯處理K562-R細(xì)胞48h時(shí)，各濃度組的細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較，都有顯著性差異(P=0.000)。組間比較顯示：相鄰濃度的組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P值依次是：P=0.011，P=0.013)。AnnexinV-PI雙染檢測(cè)顯示：4×10-5mo

13、l/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L青蒿琥酯處理K562-R細(xì)胞48h，細(xì)胞總凋亡率呈時(shí)間和濃度依賴性。多重組間比較顯示：相鄰濃度的組間凋亡率有顯著性差異(P值依次為0.000，0.003)。用半定量RT-PCR方法檢測(cè)低、中、高濃度的青蒿琥酯處理K562-R細(xì)胞48h后，青蒿琥酯使K562-R細(xì)胞表面的TfR1mRNA表達(dá)比對(duì)照組減少(0.001，0.000，0.000)，且呈濃度依賴性。低濃度青蒿琥酯使K562-R細(xì)胞

14、+IRE-DMT1mRNA表達(dá)降低，中、高濃度使其不表達(dá)。青蒿琥酯處理組FPN1mRNA表達(dá)較對(duì)照組減少(P都是0.000)，且呈濃度依賴性。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：青蒿琥酯處理組的CD71陽(yáng)性率較對(duì)照組低，且呈濃度依賴性(P=0.006，0.000，0.000)。用兔抗人的+IRE-DMT1多克隆抗體用westernblot方法研究表明：中濃度青蒿琥酯使+IRE-DMT1蛋白不表達(dá)。 初步結(jié)論： 1.CML細(xì)胞可能通過(guò)高

15、表達(dá)TfR1攝取比正常細(xì)胞更多的鐵，促進(jìn)DMT1的高表達(dá)使之能轉(zhuǎn)運(yùn)更多的Fe2+進(jìn)入細(xì)胞漿，參與細(xì)胞增殖、代謝；通過(guò)高表達(dá)FPN1mRNA使鐵外流也增多；CML患者血清鐵蛋白值高于正常對(duì)照。由于CML原代細(xì)胞可以合成和分泌鐵蛋白。因此是否提示細(xì)胞鐵內(nèi)流多于外流尚需進(jìn)一步研究。此項(xiàng)研究目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。 2.青蒿琥酯除了通過(guò)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Fe2+結(jié)合形成自由基殺死細(xì)胞外，還可能通過(guò)減低TfR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)使K

16、562細(xì)胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵減少，通過(guò)降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，使細(xì)胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿的Fe2+減少，線粒體可利用鐵也減少，通過(guò)減少FPN1mRNA的表達(dá)，使細(xì)胞鐵外流減少，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。去鐵敏可能通過(guò)增加K562細(xì)胞表面的TfR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，使K562細(xì)胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵增多，通過(guò)降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，使細(xì)胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿的Fe2+減少，線粒

17、體可利用鐵也減少，通過(guò)減少FPN1mRNA的表達(dá)使鐵外流減少，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此項(xiàng)研究尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。 3.青蒿琥酯可能通過(guò)下調(diào)TfR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)使K562-R細(xì)胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵減少，通過(guò)降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，使細(xì)胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿的Fe2+減少，線粒體可利用鐵也減少，通過(guò)減少FPN1mRNA的表達(dá)，使細(xì)胞鐵外流減少，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。此項(xiàng)研究尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)