外周血單個核細胞內(nèi)HBV的檢測對監(jiān)測肝移植患者HBV再感染的應用價值.pdf

1、乙肝相關性終末期肝病是我國肝臟移植的主要適應證，占總病因的78.8％。術后乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)再感染一直是影響受體預后的重要原因。乙肝免疫球蛋白及核苷類抗病毒藥物的聯(lián)合運用可有效的降低HBV再感染率，或使再感染與移植手術的時間間隔延長，但是HBV再感染仍然不能完全避免。HBV再感染初期往往無特異性的臨床表現(xiàn)，一旦病程進展為肝功能衰竭，將面臨再次肝移植的境地，因此監(jiān)測和早期診斷就顯得特別重要。

2、 目前臨床上常用的監(jiān)測乙肝再感染常用的指標均有不足，如肝功能檢測特異性較差，而血清乙肝病毒標志物(hepatitis B virus markers，HBVM)及血清HBV-DNA只有在HBV再感染移植肝后才能檢測到，是移植術后HBV再感染的診斷指標，并不能早期監(jiān)測，因此迫切需要尋找到一個靈敏、有效、可行的監(jiān)測方法。 研究證實：乙肝患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBM

3、C)、脾臟、骨髓、淋巴結(jié)、小腸、胰腺、腎上腺等組織中均有HBV存在，而PBMC因取材方便應用價值更大。PBMC作為肝外殘存病毒庫，是肝移植術后HBV再感染的一個主要來源之一。PBMC中殘留的HBV具備復制增殖并釋放出來的能力，即使血清HBV-DNA陰性，仍然可以在PBMC內(nèi)檢測到HBV-DNA。共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，ccc DNA)是HBV復制的模板，是證明HBV復制的最特異性

4、的指標。目前PBMC中HBV-DNA和HBV-cccDNA在慢乙肝患者的研究較多，而在病變肝臟已被去除和免疫抑制狀態(tài)的研究較少，其在肝移植術后的存在情況、變化規(guī)律以及其和HBV再感染的關系尚并不清晰。因此了解PBMC中HBV-DNA和HBV-cccDNA在肝移植術后變化規(guī)律和不同抗病毒方案下的存在狀態(tài)具有重要意義。為此，我們擬通過本實驗觀察血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及HBV-cccDNA定量在肝移植圍手術期及中長期隨

5、訪病人體內(nèi)的變化規(guī)律，旨在評價其在監(jiān)測肝移植術后體內(nèi)HBV的存在狀態(tài)和預測HBV再感染風險中的價值。 第一部分：肝移植圍手術期血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA與cccDNA檢測的價值 目的： 了解肝移植圍手術期血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA的變化規(guī)律，探討各自在監(jiān)測體內(nèi)HBV存在狀態(tài)和預測HBV再感染中的價值。 資料與方法： 選取我院移植中心2007年

6、8月至2007年12月期間采用恩替卡韋聯(lián)合小劑量乙肝免疫球蛋白作為預防HBV再感染方案的20例肝移植受體作為研究對象。分別于術前1天、術后1周、4周、12周采用實時熒光定量PCR法檢測血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA。 結(jié)果： 一、肝移植術前后各檢測指標陽性率的比較 1、術前各檢測指標中，血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及PBMC內(nèi)HBV-cccDNA的陽性率分別為70.09

7、6(14/20)、85.0％(17/20)和40.096(8/20)；術前血清HBV-DNA及PBMC內(nèi)HBV-cccDNA陽性的標本PBMC內(nèi)HBV-DNA均陽性。血清及PBMC內(nèi)HBV-DNA陽性率均高于PBMC內(nèi)HBV-cccDNA陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(p值分別為0.028和0.08)。 2、移植術后12周時，PBMC內(nèi)HBV-DNA陽性率40.0％(8/20)，而血清HBV-DNA及PBMC內(nèi)HBV-cccDNA的陽

8、性率均為0，分別與后兩者比較，差異有統(tǒng)計學差異(p=0.03)。 二、圍手術期血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA的變化趨勢 1、血清HBV-DNA術前、術后1周、4周、12周的陽性率分別為70.096(14/20)、25.0％(5/20)、5％(1/20)和0；術后1周與術前比較有統(tǒng)計學差異(p=0.01)． 2、PBMC內(nèi)HBV-DNA術前、術后1周、4周、12周的陽性率分別為85.0％

9、(17/20)、45.0％(9/20)、45.0％(9/20)和40.0％(9/20)；術后1周陽性率較術前降低有統(tǒng)計學意義(p=0.004)，術后各時間組陽性率維持在40.0％-45.0％之間，下降無統(tǒng)計學意義。 術后1周PBMC內(nèi)HBV-DNA定量值較術前明顯降低(p=0.01)，但隨術后時間的延長，下降趨勢越來越緩慢，術后12周與術后4周比較下降已沒有統(tǒng)計學意義，術后PBMC內(nèi)HBV-DNA陽性定量維持于103～104拷貝

10、/106細胞水平。 3、術前PBMC內(nèi)HBV-cccDNA檢測陽性率40％，術后1周時僅有1例HBV-cccDNA陽性，下降有統(tǒng)計學意義(p=0.01)；4周以后未檢測到HBV-cccDNA陽性。 三、肝移植術后血清、PBMC內(nèi)HBY-DNA及cccDNA陰轉(zhuǎn)率比較 1.術后1周時，血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及PBMc內(nèi)HBV-cccDNA的陰轉(zhuǎn)率分別為64.3％(9/14)、47.1％(8/1

11、7)和87.5％(7/8)：三組陰轉(zhuǎn)率互相比較，P值均＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。 2.術后4周時，血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及PBMC內(nèi)HBV-cccDNA的陰轉(zhuǎn)率分別為92.996(13/14)、47.1％(8/17)和100％(8/8)；PBMC內(nèi)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率與后兩者比較，P值分別為0.009和0.022，差異有統(tǒng)計學意義。 3.術后12周時，PBMC內(nèi)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率為52.94％

12、(9/17)，而血清HBV-DNA及PBMC內(nèi)HBV-cccDNA均全部陰轉(zhuǎn)，PBMC內(nèi)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率與后兩者比較，P值分別為0.003和0.026，差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1、PBMC內(nèi)HBV-DNA定量術后陰轉(zhuǎn)率低，長期陽性并維持在較低水平。 2、PBMC內(nèi)HBV-DNA定量術后檢測能更好的反映肝移植圍手術期體內(nèi)殘存病毒的存在及活動狀態(tài)，可能較血清HBV-DNA檢測更適合于監(jiān)測HBV再感染。

13、 3、目前的檢測方法PBMc內(nèi)HBV-cccDNA檢測敏感度低，不適合作為監(jiān)測指標。 第二部分：肝移植術后中長期隨訪病人血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA檢測的價值 目的： 通過對肝移植術后中長期隨訪病人血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA的檢測，了解各指標長期的變化趨勢，探討其在預測HBV再感染及評價藥物療效中的價值。 資料與方法： 選取我科2004

14、年3月至2007年12月期間行肝移植術，術前HbsAg陽性，術后規(guī)律隨訪的90例病人作為研究對象。其中56例采用拉米夫定聯(lián)合HBIG抗病毒治療，34采用恩替卡韋聯(lián)合HBIG作為預防HBV再感染方案。于隨訪結(jié)束時采用實時熒光定量PCR法檢測血清HBV-DNA、PBMC內(nèi)HBV-DNA及cccDNA。 結(jié)論： 1、肝移植術后使用拉米夫定或恩替卡韋聯(lián)合小劑量HBIG，均不能完全清除病毒，PBMC內(nèi)持續(xù)有HBV存在，受體仍有HB