PEDV Nsp7對Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響及基于Nsp7間接ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)主要導(dǎo)致哺乳仔豬的嚴(yán)重嘔吐、腹瀉、脫水和死亡，也可引起懷孕母豬的腹瀉、無乳和生殖周期異常，多個(gè)地區(qū)連續(xù)出現(xiàn)的多個(gè)突變株加劇了PEDV的流行，給許多國家的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV感染能夠強(qiáng)烈抑制宿主Ⅰ型干擾素應(yīng)答，但是其調(diào)控機(jī)制尚不完全明了。發(fā)掘新的調(diào)控宿主抗病毒應(yīng)答的病毒蛋白，將有助于揭示PEDV如何逃逸機(jī)體抗病毒應(yīng)答。并且，鑒于PED

2、V毒株類型較多，且該病毒主要危害2周齡以內(nèi)仔豬，呈現(xiàn)發(fā)病急、病程短的特點(diǎn)，所以發(fā)展一種能廣泛用于PEDV不同毒株的檢測以及能用于PEDV的早期診斷的方法將為制定防控PED措施提供指導(dǎo)。
　　冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)基因在病毒的復(fù)制和致病過程中發(fā)揮重要作用。本研究首次鑒定了PEDV的非結(jié)構(gòu)蛋白7(nonstructural protein7，Nsp7)，分析了它的序列特征、對其進(jìn)行了原核表達(dá)及免疫原性研究，并確定了其真核表達(dá)、亞細(xì)胞定位以及

3、對Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響，另外，本論文利用純化的原核Nsp7作為儉測抗原，建立了一種可用于PEDV不同毒株的檢測和病毒早期診斷的ELISA方法。本論文分為以下三個(gè)研究內(nèi)容:
　　1.豬流行性腹瀉病毒Nsp7生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)與多克隆抗體制備
　　為了解PEDV Nsp7的結(jié)構(gòu)特征和免疫原性，本研究通過生物信息學(xué)分析Nsp7序列特征、理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上對Nsp7進(jìn)行原核表達(dá)和純化并制備抗Nsp7多克隆抗體。生物

4、信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Nsp7基囚大小為249bp，在不同PEDV毒株間高度保守;Nsp7為穩(wěn)定蛋白，以單體形式存在，三級結(jié)構(gòu)主要由4個(gè)α螺旋片組成。SDS-PAGE試驗(yàn)表明，Nsp7在大腸桿菌中獲得大量表達(dá)，經(jīng)純化后得到單一條帶。采用純化的Nsp7免疫兔子制備多克隆抗體，經(jīng)ELISA法檢測抗體效價(jià)為1∶32000，進(jìn)一步的Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，多克隆抗體能夠特異性識別重組Nsp7蛋白和PEDV感染細(xì)胞的Ns

5、p7蛋白，為后續(xù)研究Nsp7的亞細(xì)胞定位和功能以及以Nsp7為檢測靶標(biāo)的ELISA方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　2.Nsp7的真核表達(dá)、亞細(xì)胞定位和對Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響
　　為研究PEDV Nsp7的真核表達(dá)、亞細(xì)胞定位和對細(xì)胞Ⅰ型干擾素(IFN)應(yīng)答的影響，本試驗(yàn)克隆Nsp7基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pCAGGS-Nsp7;分別采用Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測Nsp7在細(xì)胞中的表達(dá)和分布，并進(jìn)一步通過報(bào)告基因法

6、、ELISA、實(shí)時(shí)定量PCR以及病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)評估Nsp7對Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響。Western blot結(jié)果顯示，Nsp7能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高效表達(dá);間接免疫熒光試驗(yàn)顯示Nsp7主要定位在細(xì)胞質(zhì)，僅少量分布在細(xì)胞核;雙熒光報(bào)告基因試驗(yàn)表明Nsp7能顯著抑制IFN-β啟動子活性，ELISA結(jié)果顯示Nsp7能顯著抑制IFN-β蛋白水平的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示Nsp7能顯著下調(diào)一些ISGs（ISG15、ISG20和ISG56）基因的轉(zhuǎn)

7、錄水平，同時(shí)水皰性口炎病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)顯示Nsp7明顯抑制poly(I∶C)介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。結(jié)果提示，Nsp7作為PEDV的保守蛋白，具有拮抗Ⅰ型IFN應(yīng)答的功能.為探討和揭示PEDV逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的機(jī)制及指導(dǎo)臨床疫苗使用奠定基礎(chǔ)。
　　3.PEDV Nsp7蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用
　　鑒于PEDV毒株類型較多，且PEDV主要危害2周齡以內(nèi)仔豬，發(fā)病急、病程短，因此該病的廣泛診斷和早期

8、診斷對于該疾病的預(yù)防與控制具有十分重要的意義。試驗(yàn)一的研究結(jié)果顯示PEDV Nsp7免疫原性良好，且Nsp7基因在PEDV不同毒株間高度保守，鑒于此，本試驗(yàn)以純化的Nsp7蛋白作為包被抗原，對各種檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立一種可以廣泛檢測抗PEDV不同毒株抗體的間接ELISA方法。所建立的ELISA方法的最佳反應(yīng)條件為:抗原包被量為0.2μg/孔，包被條件為37℃1h之后4℃過夜;血清稀釋度為1∶300，作用時(shí)間為2h;酶標(biāo)二抗最適稀釋度

9、為1∶10000，作用時(shí)間為1.5h;TMB顯色液作用時(shí)間為15min。在優(yōu)化條件下，臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)為:樣品S/P值≥0.1694判為陽性，S/P值＜0.1398判為陰性。所建立的ELISA方法特異性、重復(fù)性及敏感性均良好。用所建立的ELISA方法對40份來自于疑似豬PEDV血清樣品進(jìn)行檢測，該方法與商品化試劑盒檢測之間的符合率為95％。本研究建立的ELISA方法在臨床上可用于PEDV不同毒株抗體水平的檢測，也有用于PEDV早期診斷的