人抗PRP8（pre-mRNA processing factor 8）分子單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、Prp8p是迄今已知的最保守的核蛋白之一,生物化學(xué)、遺傳學(xué)等的研究表明,PIp8p可與多種剪切因子發(fā)生反應(yīng),是U5snRNP的組成部分,在U4/U6-U5三聚體的形成過程中,prp8p與U6snRNP上的一個(gè)與剪切復(fù)合體催化核心形成相關(guān)的保守區(qū)域相接觸,為U4/U6-U5三聚體的裝配形成所必需,并且通過促進(jìn)三聚體與5'及3'端剪切位點(diǎn)的相互結(jié)合,保持snRNPs之間的相互作用的穩(wěn)定性而促進(jìn)剪切復(fù)合體催化核心的形成.PRP8分子的JAB功

2、能區(qū)能夠促進(jìn)Pv8p的穩(wěn)定表達(dá),是Prp8p與泛素相互作用的區(qū)域,目前,尚無研究揭示泛素在前體mRNA剪切過程中的具體作用,在其他的剪切相關(guān)蛋白中也沒有發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,JAB功能區(qū)作為一個(gè)新的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,了解其功能對于研究泛素與前體mRNA的剪切機(jī)制有著重要的意義. 本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)的方式制備PRPS-JAB融合蛋白,免疫Balb/c鼠后,通過細(xì)胞融合制備單克隆抗體并對所制備抗體進(jìn)行初步鑒定. 首先,原核表達(dá)選擇p

3、GEX-5X-1、pET-32a載體作為表達(dá)載體,根據(jù)載體的酶切圖譜設(shè)計(jì)引物,將PRP8-JAB domain基因序列分別插入到pGEX-5X-1、pET-32a載體的EcoRI和Notl兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)之間,PCR反應(yīng)后,得到目的條帶;將擴(kuò)增的目的片段從膠上回收后,進(jìn)行T載體的連接;轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒后雙酶切,再與同時(shí)雙酶切的表達(dá)載體pGEX-5X-1、pET-32a載體進(jìn)行連接,然后再轉(zhuǎn)化,各挑取兩個(gè)陽性克隆,搖茵后,進(jìn)行測序鑒定.將

4、測序鑒定正確的PRP8-JAB表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21菌株后誘導(dǎo)表達(dá),獲得正確表達(dá)的目的蛋白PRP8-JAB并純化; 其次,將純化的GST-PRP8-JAB融合蛋白與等體積福氏完全佐劑進(jìn)行充分乳化,對Balb/c小鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射.首次免疫后4周加強(qiáng)免疫一次,免疫原用量減為首免得一半,并與福氏不完全佐劑充分乳化.兩周后ELISA法檢測效價(jià),效價(jià)在1:8000以上的小鼠即可進(jìn)行加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫三天后進(jìn)行細(xì)胞融合,ELISA法篩選能

5、夠穩(wěn)定分泌抗PRPS-JAB mAb的陽性克隆,并亞克隆,共獲得17株能夠穩(wěn)定分泌PRP8-JAB單克隆抗體的細(xì)胞系; 第三,用HIS-PRP84AB融合蛋白通過Western blot對所獲單克隆抗體的進(jìn)行鑒定,同時(shí),根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道<'[21]>,用RIPA裂解液裂解Hela細(xì)胞,以Hela細(xì)胞總蛋白為電泳樣品,Western blot鑒定單克隆抗體的特異性.LDE021、LGB057、LED096、 LEB0311、LAB

6、013、LGB071、LAD0224、LIA083、LIF022、LBDl010、LHB0614、 LHB0510、LHB0924、LCE041、LGB031、LGC093均可以識(shí)別mS-PRP8-JAB融合蛋白,其中有11株抗體LAD0224、LCE041、LCF041、LDE021、LEB0311、LED096、 LGB071、LGC093、LHB0510、LHB0614、LIF022可以特異的識(shí)別Hela細(xì)胞中分子量約為220kD