PC-1協(xié)同CHIP調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中AR蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌是男性多發(fā)的惡性腫瘤，且其在全世界的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。早在1941年，雄激素在前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)中的作用首先是由Huggins等闡述的。他們注意到前列腺腫瘤的體積在去除雄激素之后縮小。從此之后，去除雄激素已經(jīng)成為了治療早期前列腺癌的主要方法。在治療的初期，由于引發(fā)細(xì)胞凋亡，腫瘤的質(zhì)量不斷的減小。然而不幸的是，前列腺癌通常在治后的18-36個(gè)月中復(fù)發(fā)，并且惡化成為去勢(shì)抗性的前列腺癌(Cast

2、ration-resistantprostate cancer，CRPC)。在CRPC中，雄激素受體(Androgen Receptor，AR)的狀態(tài)因雄激素處于去勢(shì)的水平下而活化，通常也伴隨著AR的表達(dá)量亦開(kāi)始上升，通常此時(shí)的AR對(duì)雄激素高度地敏感，且AR的活性能被一些非經(jīng)典通路所激活，或者是處于組成型的激活狀態(tài)。迄今為止，臨床上針對(duì)前列腺癌的治療尚沒(méi)有突破性的進(jìn)展。因此，探究并闡明前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中其復(fù)雜的分子機(jī)制，并且提出靶

3、向有效的診斷、治療方法，將是目前及未來(lái)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。
　　雄激素受體AR是類固醇激素受體家族的一員，該家族的其他成員還包括雌激素，孕酮，鹽皮質(zhì)激素以及糖皮質(zhì)激素。AR能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分泌作用及凋亡，在前列腺、良性的前列腺增生以及前列腺癌的惡性程度進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。雄激素受體AR是一個(gè)由919個(gè)氨基酸組成的蛋白，基因全長(zhǎng)約180kb，位于編號(hào)為Xq11-12的染色體上。AR是由三個(gè)主要的功能區(qū)域組成的。其中最大

4、的氮端區(qū)域(N-terminal domain,NTD)包含了半數(shù)以上的受體部分，并且含有兩個(gè)激活功能區(qū)(activation function，AF)之一。AR中的第二個(gè)功能域是DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domai，DBD)，其中包含了兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain，LBD)通過(guò)一段短的靈活的肽序列構(gòu)成的鉸鏈區(qū)與DBD連接。
　　PC-1基因(Prostate a

5、nd Colon gene1)是由周建光研究員等篩選并且克隆出的新基因，該基因的表達(dá)量在雄激素依賴的、非轉(zhuǎn)移的早期前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中較低，而在雄激素非依賴的、可轉(zhuǎn)移的晚期前列腺癌細(xì)胞系C4-2中較高。PC-1蛋白由224個(gè)氨基酸組成，屬于TPD52(Tumor Protein D52)癌蛋白家族，PC-1與D52家族的蛋白高度同源的序列有180個(gè)氨基酸，位于C端，而PC-1蛋白的特異性區(qū)域則是其位于N端的46個(gè)氨基酸。前期研究提

6、示我們，PC-1基因在前列腺癌中所發(fā)揮的特異性的作用可能源于其癌基因的身份。然而，目前對(duì)于PC-1發(fā)揮生物學(xué)功能詳細(xì)的分子機(jī)制，以及其在前列腺癌臨床治療中的作用尚不明確。因此在本文中，為了探究在前列腺癌細(xì)胞中PC-1基因的表達(dá)在其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中所起的作用及其分子機(jī)制，我們進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)，并取得了以下的幾項(xiàng)進(jìn)展:
　　(1)首先在非前列腺癌細(xì)胞293T瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC-1與AR質(zhì)粒，通過(guò)western blot檢測(cè)到PC-1與AR蛋白

7、量之間的相關(guān)性:PC-1過(guò)表達(dá)時(shí)，AR蛋白量降低，且呈劑量效應(yīng)。然后，構(gòu)建過(guò)表達(dá)PC-1的雄激素依賴的前列腺癌LNCaP穩(wěn)定細(xì)胞系及敲低PC-1表達(dá)的雄激素非依賴的前列腺癌C4-2穩(wěn)定細(xì)胞系，再次驗(yàn)證了PC-1與AR蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性。接著，用放線菌酮(Cycloheximide，CHX)來(lái)抑制AR的蛋白合成后發(fā)現(xiàn)在PC-1存在時(shí)能使AR蛋白的半衰期縮短。所以從蛋白降解經(jīng)典通路泛素-蛋白酶體通路角度研究，AR蛋白的泛素化實(shí)驗(yàn)證明了PC

8、-1是通過(guò)蛋白酶體通路來(lái)調(diào)控AR蛋白水平的。
　　(2)為探究PC-1與AR之間的相關(guān)性是否是通過(guò)兩者間直接的相互作用導(dǎo)致的。通過(guò)GST-pull down實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源或內(nèi)源表達(dá)的PC-1與AR之間均存在蛋白質(zhì)之間的相互作用，且能與PC-1發(fā)生相互作用的區(qū)段是AR的第629-634位的鉸鏈區(qū)。
　　(3)上述結(jié)果表明，PC-1是通過(guò)與AR的第629-634位的鉸鏈區(qū)發(fā)生蛋白質(zhì)間相互作用，最終通過(guò)蛋白酶體通路來(lái)

9、調(diào)控AR蛋白水平的。相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CHIP(carboxy terminus of Hsc70 interacting protein，C末端Hsp/Hsc70交互作用蛋白)能夠發(fā)揮E3泛素連接酶的作用。為研究PC-1是否是通過(guò)CHIP這一新的E3泛素化連接酶來(lái)調(diào)控AR的蛋白量有待研究。通過(guò)GST-pull down實(shí)驗(yàn)及外源、內(nèi)源免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，分別從正向或反向檢測(cè)到PC-1、CHIP及AR三者之間存在蛋白質(zhì)之間的相互作用，并且

10、PC-1過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)AR和CHIP蛋白之間的相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)CHIP參與的AR泛素-蛋白酶體降解的過(guò)程。
　　(4)通過(guò)在293T細(xì)胞中外源轉(zhuǎn)染PC-1、AR和CHIP質(zhì)粒，進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白量水平上，研究發(fā)現(xiàn)在PC-1與CHIP共同協(xié)作時(shí)，AR的蛋白量比它們單獨(dú)存在時(shí)要低。且將293細(xì)胞的內(nèi)源性CHIP蛋白通過(guò)RNAi技術(shù)敲低后，過(guò)表達(dá)PC-1不能使AR蛋白量下降。利用AR蛋白泛素化實(shí)驗(yàn)，證明PC-1能促進(jìn)

11、CHIP介導(dǎo)的AR的泛素-蛋白酶體降解過(guò)程。
　　(5)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)PC-1能夠在細(xì)胞周期G2/M期中高表達(dá)。通過(guò)諾考達(dá)唑(Nocodazole)、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)將細(xì)胞進(jìn)程阻滯在細(xì)胞周期的G2/M期時(shí)，PC-1過(guò)表達(dá)能使AR與CHIP蛋白量的降低程度增加。表明，PC-1能夠協(xié)同CHIP參與G2/M期AR的降解。然而具體的作用機(jī)制尚未清楚，有待進(jìn)一步研究。
　　(6)用L