雙陰性T細胞通過mfgl2凝血酶原酶途徑和活化NK細胞共同參與小鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)生發(fā)展.pdf

1、研究背景及目的:
　　病毒性肝炎是由多種不同嗜肝病毒包括甲、乙、丙、丁以及戊型肝炎病毒或其他病毒如單純皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒等,引起的一組以肝臟損害為主要臨床特征的急或慢性傳染病,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染在中國仍然較為普遍,人群攜帶率高達7.18％。由其發(fā)展的重型病毒性肝炎(fulminant viral hepatitis,FVH)或者肝功能衰竭病情極為兇險,是一類在短期內(nèi)出現(xiàn)肝

2、細胞的大量壞死、嚴重肝功能不良甚至合并嚴重并發(fā)癥如肝性腦病、自發(fā)性細菌性腹膜炎、肝腎綜合征等為臨床特征的嚴重肝臟疾病。由于臨床上缺乏有效特異的治療措施和干預(yù)手段,若不及時進行肝移植,其臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后非常差。有研究證實3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain3,MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎,其病程轉(zhuǎn)歸及疾病預(yù)后和人類 FVH相似,因此目前是研究 FVH良好的動物模型之一。
　　FVH的發(fā)病機制非

3、常復(fù)雜,肝炎病毒感染并在肝細胞內(nèi)大量復(fù)制,通常不直接引起肝細胞變性壞死,肝細胞損傷主要是由于宿主針對病毒產(chǎn)生的一系列免疫應(yīng)答尤其是細胞免疫造成的,其中針對肝炎病毒蛋白抗原特異性的CD8+T淋巴細胞(CTL)對于肝炎病毒的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸具有關(guān)鍵作用,然而其他免疫細胞尤其是調(diào)節(jié)性 T細胞在 FVH中的作用尚未完全明確。研究證實肝臟內(nèi)淋巴細胞是肝內(nèi)非實質(zhì)細胞的重要組成部分,由病毒誘導(dǎo)的人類小鼠和肝臟疾病中會發(fā)生肝臟內(nèi)炎癥細胞的大量聚集。肝臟

4、在慢性病毒性肝炎過程中維系著一種免疫耐受的狀態(tài),其中調(diào)節(jié)性 T細胞是機體維持自身免疫耐受的重要細胞組分,在保持生理狀態(tài)機體免疫平衡、移植免疫耐受、自身免疫性疾病等病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前在肝臟疾病研究較多的調(diào)節(jié)性T細胞中是 CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory T cell,Treg),主要可以通過分泌的抑制性細胞因子如白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)以及轉(zhuǎn)移生長因子-β

5、(transforming growth factor-β,TGF-β)來發(fā)揮其抑制性的免疫調(diào)節(jié)的作用。除此以外,越來越多的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞被證實,如自然殺傷性 T細胞(natural killer T cell,NK T)、CD3+CD4-CD8-雙陰性 T細胞(double negative T cell,DN T細胞)、γδT細胞等。然而調(diào)節(jié)性 T細胞在不同的疾病模型中其表型和功能存在明顯差異,比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(syste

6、mic lupus erythematosus,SLE)中DN T細胞能夠促進機體產(chǎn)生自身抗體;在立什曼原蟲感染中,TCRαβ+DN T細胞可發(fā)揮促進了炎癥發(fā)展的作用;Treg在 MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,通過表達纖維蛋白原樣蛋白/纖維介素2(fibrinogen like protein2/fibroleukin,fgl2)促進暴發(fā)型肝炎的發(fā)生等。γδT細胞是一種表型和功能獨特的T淋巴細胞,主要由 CD4-CD8-γδT細

7、胞亞群組成,僅少數(shù)為CD4-CD8+γδT細胞亞群。目前對于 DN T細胞以及γδT細胞在 FVH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用的相關(guān)報道較少。
　　fgl2包括跨膜型以及分泌型并發(fā)揮不同的功能。其中跨模型 fgl2是一種新型的凝血酶原酶分子,主要由活化的巨噬細胞或內(nèi)皮細胞表達,通過促進凝血酶原的裂解以及纖維蛋白的沉積,最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙和肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生,在 FVH中肝細胞缺氧性損傷和大量炎性壞死的發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用。本研究室前期研

8、究結(jié)果顯示,通過干擾小鼠體內(nèi) fgl2的表達,可導(dǎo)致暴發(fā)性肝炎小鼠的生存率顯著升高。有研究證實 Treg可以通過產(chǎn)生分泌型 fgl2促進暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其他免疫細胞如DN T細胞與 fgl2的關(guān)系尚無研究。本研究室前期結(jié)果提示 MHV-3在感染 BALB/cJ小鼠后,有一群表型功能均與以往報道不同的DN T細胞,在疾病進程中出現(xiàn)數(shù)量的顯著增加及大量活化,同時表達 fgl2分子,轉(zhuǎn)移過繼這群細胞會促進小鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其深入

9、的機制需要進一步研究。為探索 DN T細胞及γδT細胞在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中的作用及機制,本課題具體研究目標如下:
　　1.研究脾臟 DN T細胞 mfgl2的表達及促凝血功能.
　　2.研究脾臟 DN T細胞通過表達 mfgl2促進暴發(fā)型肝炎發(fā)生的機制.
　　3.初步探索肝臟 DN T細胞促進 NK細胞活化的機制.
　　4.研究肝臟γδT細胞在小鼠暴發(fā)性肝炎中的作用及機制.
　　研究方法:
　　1.

10、采用MHV-3經(jīng)腹腔注射途徑感染BALB/cJ小鼠建立暴發(fā)性小鼠肝炎模型,在不同感染時間點0h、24h、48h以及72h時對小鼠肝組織行伊紅-蘇木精染色(HE染色),觀察肝臟病理學(xué)改變,并檢測血清ALT和AST水平。
　　2.磁珠分選正常以及MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟 DN T細胞,通過免疫共聚焦法檢測其 mfgl2的表達,并通過促凝活性檢測實驗(procoagulant assay,PCA)體外檢測脾臟 DN

11、 T細胞的功能。
　　3.使用特異性針對 mfgl2的microRNA腺病毒體內(nèi)干擾 BALB/cJ小鼠的mfgl2表達,并通過尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟 DN T細胞,觀察小鼠生存率,檢測肝臟病理學(xué)改變及血清 ALT和AST水平變化,同時通過 real-time PCR以及western blot來檢測肝臟 mfgl2的分子及蛋白水平的表達情況。
　　4.尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的B

12、ALB/cJ小鼠的DN T細胞,觀察小鼠肝臟內(nèi) NK細胞的CD69表達情況,體外將感染48h時分離的肝臟 DN T細胞以及感染24h分離的肝臟 NK細胞,體外共培養(yǎng)12h后,體外檢測 CD69表達、胞內(nèi)干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌,以及利用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)釋放實驗檢測 NK細胞對原代肝細胞的殺傷作用的變化。
　　5.流式細胞術(shù)檢測γδT細胞在肝臟、

13、脾臟和外周血等器官的比例數(shù)量以及活化水平變化,同時檢測肝臟γδT細胞的表面分子包括 CD25、CD28、CD30、CD44的表達,通過胞內(nèi)細胞因子染色檢測 MHV-3感染前后肝臟γδT細胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、IFN-γ、TNF-α、穿孔素(perforin)、顆粒酶(granzyme B)等細胞因子譜的水平,檢測γδT細胞表面α-Galcer二聚體來鑒定γδT細胞是否為傳統(tǒng)的NKT細胞。
　

14、　6.磁珠分選肝臟γδT細胞,原位灌流膠原酶消化法分離小鼠原代肝細胞,利用LDH釋放實驗檢測肝臟γδT細胞在體外對原代肝細胞的殺傷作用,體外使用單克隆抗體阻斷 IFN-γ、TNF-α來驗證肝臟γδT細胞損傷肝細胞的主要分子途徑。
　　實驗結(jié)果:
　　1.MHV-3感染 BALB/cJ小鼠后,隨著感染時間的延長,肝臟組織病理學(xué)首先出現(xiàn)肝細胞嗜酸性變以及氣球樣變,形成點狀和局灶狀壞死,伴隨大量淋巴細胞浸潤,最后出現(xiàn)大面積肝細胞破

15、壞,網(wǎng)織纖維塌陷等改變。同時 BALB/cJ小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶 ALT、AST水平顯著升高,在感染后72h時分別達到最高值(9418.7±23.6 IU/L,8195.3±224.0 IU/L)。
　　2.通過免疫共聚焦法檢測發(fā)現(xiàn) MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟 DN T細胞高表達 mfgl2,與前期 real-time PCR和western blot的檢測結(jié)果相一致。mfgl2集中在 DN T細胞膜上表達,初步證實為

16、跨模型 mfgl2。另外體外促凝活性實驗檢測結(jié)果顯示這群表達 mfgl2的DN T細胞在體外具有 PCA活性(0h為30.30±52.48 mU/ml,48h為651.51±301.80 mU/ml),進一步驗證該 mfgl2分子為傳統(tǒng)跨模型mfgl2.
　　3.BALB/cJ小鼠體內(nèi)使用特異性針對 mfgl2的microRNA腺病毒可有效干擾肝內(nèi)mfgl2分子及蛋白水平的表達,使生存率提高至33.3％,同時顯著改善肝臟組織病理學(xué)

17、改變,降低血清 ALT、AST水平,在這種情況下,尾靜脈高壓注射 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟 DN T細胞會逆轉(zhuǎn) mfgl2 microRNA的干擾作用,導(dǎo)致肝內(nèi) mfgl2表達水平升高,發(fā)生明顯肝組織病理學(xué)改變,血清 ALT、AST水平顯著升高,小鼠全部死亡。
　　4.尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠體內(nèi)分離的DN T細胞后24h,小鼠肝臟內(nèi) NK細胞表達 CD69的水平顯著升高,出現(xiàn)明顯活

18、化。將肝臟 DN T細胞以及NK細胞體外共培養(yǎng)12h,DN T細胞可促進 NK細胞表達 CD69比例增加,同時分泌炎性細胞因子 IFN-γ及TNF-α水平升高,NK細胞對原代肝細胞的殺傷作用明顯增強。
　　5.流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),MHV-3感染 BALB/cJ小鼠48h時,無論在外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細胞的比例較正常時顯著升高,絕對計數(shù)結(jié)果顯示隨著感染時間的延長,外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細胞的總數(shù)顯著下降。肝臟內(nèi)γδT細胞表

19、面高表達 CD44分子,但無明顯 CD25、CD28及CD30分子的表達,經(jīng)鑒別該群γδT細胞并非傳統(tǒng)的NK T細胞,同時隨著感染時間的延長,γδT細胞表達活化分子CD69的比例顯著升高。對肝臟γδT細胞胞內(nèi)細胞因子譜檢測發(fā)現(xiàn),感染后的γδT細胞分泌 IFN-γ及TNF-α水平明顯增加,其他細胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、perforin、granzyme B無明顯表達。
　　6.通過 LDH釋放殺

20、傷實驗檢測發(fā)現(xiàn),MHV-3感染 BALB/cJ小鼠48h肝臟內(nèi)分離的γδT細胞對感染的原代肝細胞隨著效靶細胞比例的升高其體外殺傷作用明顯增強,單用或合用IFN-γ及TNF-α的單克隆阻斷性抗體,可顯著降低γδT細胞對原代肝細胞的殺傷作用,以 TNF-α阻斷后的效果更明顯。
　　結(jié)論:
　　1.本研究基于前期實驗結(jié)果更深入探討了DN T細胞通過高表達膜型 mfgl2分子,促進免疫凝血的作用,導(dǎo)致大量肝細胞的炎性壞死,最終誘導(dǎo)了

21、暴發(fā)型病毒性肝炎的發(fā)生。
　　2.DN T細胞體內(nèi)及體外均可促進 NK細胞的活化,并誘導(dǎo) NK細胞產(chǎn)生大量炎性細胞因子,增強 NK細胞對肝細胞的殺傷作用,可能為 DN T細胞促進暴發(fā)型小鼠肝炎的發(fā)生的另一條途徑。以上兩個方面的研究結(jié)果為進一步闡明病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎的發(fā)病機制提供了理論依據(jù),亦為臨床上暴發(fā)型病毒性肝炎的免疫學(xué)治療提供了重要的靶點。
　　3.γδT細胞在 MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,其比例在感染后顯著