雙陰性T細(xì)胞通過mfgl2凝血酶原酶途徑和活化NK細(xì)胞共同參與小鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)生發(fā)展.pdf

1、研究背景及目的:
　　病毒性肝炎是由多種不同嗜肝病毒包括甲、乙、丙、丁以及戊型肝炎病毒或其他病毒如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等,引起的一組以肝臟損害為主要臨床特征的急或慢性傳染病,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染在中國(guó)仍然較為普遍,人群攜帶率高達(dá)7.18％。由其發(fā)展的重型病毒性肝炎(fulminant viral hepatitis,FVH)或者肝功能衰竭病情極為兇險(xiǎn),是一類在短期內(nèi)出現(xiàn)肝

2、細(xì)胞的大量壞死、嚴(yán)重肝功能不良甚至合并嚴(yán)重并發(fā)癥如肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝腎綜合征等為臨床特征的嚴(yán)重肝臟疾病。由于臨床上缺乏有效特異的治療措施和干預(yù)手段,若不及時(shí)進(jìn)行肝移植,其臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后非常差。有研究證實(shí)3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain3,MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎,其病程轉(zhuǎn)歸及疾病預(yù)后和人類 FVH相似,因此目前是研究 FVH良好的動(dòng)物模型之一。
　　FVH的發(fā)病機(jī)制非

3、常復(fù)雜,肝炎病毒感染并在肝細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制,通常不直接引起肝細(xì)胞變性壞死,肝細(xì)胞損傷主要是由于宿主針對(duì)病毒產(chǎn)生的一系列免疫應(yīng)答尤其是細(xì)胞免疫造成的,其中針對(duì)肝炎病毒蛋白抗原特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)于肝炎病毒的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸具有關(guān)鍵作用,然而其他免疫細(xì)胞尤其是調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞在 FVH中的作用尚未完全明確。研究證實(shí)肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞是肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分,由病毒誘導(dǎo)的人類小鼠和肝臟疾病中會(huì)發(fā)生肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞的大量聚集。肝臟

4、在慢性病毒性肝炎過程中維系著一種免疫耐受的狀態(tài),其中調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞是機(jī)體維持自身免疫耐受的重要細(xì)胞組分,在保持生理狀態(tài)機(jī)體免疫平衡、移植免疫耐受、自身免疫性疾病等病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前在肝臟疾病研究較多的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中是 CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg),主要可以通過分泌的抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)以及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β

5、(transforming growth factor-β,TGF-β)來發(fā)揮其抑制性的免疫調(diào)節(jié)的作用。除此以外,越來越多的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞被證實(shí),如自然殺傷性 T細(xì)胞(natural killer T cell,NK T)、CD3+CD4-CD8-雙陰性 T細(xì)胞(double negative T cell,DN T細(xì)胞)、γδT細(xì)胞等。然而調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞在不同的疾病模型中其表型和功能存在明顯差異,比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(syste

6、mic lupus erythematosus,SLE)中DN T細(xì)胞能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體;在立什曼原蟲感染中,TCRαβ+DN T細(xì)胞可發(fā)揮促進(jìn)了炎癥發(fā)展的作用;Treg在 MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,通過表達(dá)纖維蛋白原樣蛋白/纖維介素2(fibrinogen like protein2/fibroleukin,fgl2)促進(jìn)暴發(fā)型肝炎的發(fā)生等。γδT細(xì)胞是一種表型和功能獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞,主要由 CD4-CD8-γδT細(xì)

7、胞亞群組成,僅少數(shù)為CD4-CD8+γδT細(xì)胞亞群。目前對(duì)于 DN T細(xì)胞以及γδT細(xì)胞在 FVH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用的相關(guān)報(bào)道較少。
　　fgl2包括跨膜型以及分泌型并發(fā)揮不同的功能。其中跨模型 fgl2是一種新型的凝血酶原酶分子,主要由活化的巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),通過促進(jìn)凝血酶原的裂解以及纖維蛋白的沉積,最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙和肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生,在 FVH中肝細(xì)胞缺氧性損傷和大量炎性壞死的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究室前期研

8、究結(jié)果顯示,通過干擾小鼠體內(nèi) fgl2的表達(dá),可導(dǎo)致暴發(fā)性肝炎小鼠的生存率顯著升高。有研究證實(shí) Treg可以通過產(chǎn)生分泌型 fgl2促進(jìn)暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其他免疫細(xì)胞如DN T細(xì)胞與 fgl2的關(guān)系尚無研究。本研究室前期結(jié)果提示 MHV-3在感染 BALB/cJ小鼠后,有一群表型功能均與以往報(bào)道不同的DN T細(xì)胞,在疾病進(jìn)程中出現(xiàn)數(shù)量的顯著增加及大量活化,同時(shí)表達(dá) fgl2分子,轉(zhuǎn)移過繼這群細(xì)胞會(huì)促進(jìn)小鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)生,然而其深入

9、的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。為探索 DN T細(xì)胞及γδT細(xì)胞在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中的作用及機(jī)制,本課題具體研究目標(biāo)如下:
　　1.研究脾臟 DN T細(xì)胞 mfgl2的表達(dá)及促凝血功能.
　　2.研究脾臟 DN T細(xì)胞通過表達(dá) mfgl2促進(jìn)暴發(fā)型肝炎發(fā)生的機(jī)制.
　　3.初步探索肝臟 DN T細(xì)胞促進(jìn) NK細(xì)胞活化的機(jī)制.
　　4.研究肝臟γδT細(xì)胞在小鼠暴發(fā)性肝炎中的作用及機(jī)制.
　　研究方法:
　　1.

10、采用MHV-3經(jīng)腹腔注射途徑感染BALB/cJ小鼠建立暴發(fā)性小鼠肝炎模型,在不同感染時(shí)間點(diǎn)0h、24h、48h以及72h時(shí)對(duì)小鼠肝組織行伊紅-蘇木精染色(HE染色),觀察肝臟病理學(xué)改變,并檢測(cè)血清ALT和AST水平。
　　2.磁珠分選正常以及MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟 DN T細(xì)胞,通過免疫共聚焦法檢測(cè)其 mfgl2的表達(dá),并通過促凝活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(procoagulant assay,PCA)體外檢測(cè)脾臟 DN

11、 T細(xì)胞的功能。
　　3.使用特異性針對(duì) mfgl2的microRNA腺病毒體內(nèi)干擾 BALB/cJ小鼠的mfgl2表達(dá),并通過尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾臟 DN T細(xì)胞,觀察小鼠生存率,檢測(cè)肝臟病理學(xué)改變及血清 ALT和AST水平變化,同時(shí)通過 real-time PCR以及western blot來檢測(cè)肝臟 mfgl2的分子及蛋白水平的表達(dá)情況。
　　4.尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的B

12、ALB/cJ小鼠的DN T細(xì)胞,觀察小鼠肝臟內(nèi) NK細(xì)胞的CD69表達(dá)情況,體外將感染48h時(shí)分離的肝臟 DN T細(xì)胞以及感染24h分離的肝臟 NK細(xì)胞,體外共培養(yǎng)12h后,體外檢測(cè) CD69表達(dá)、胞內(nèi)干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌,以及利用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NK細(xì)胞對(duì)原代肝細(xì)胞的殺傷作用的變化。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞在肝臟、

13、脾臟和外周血等器官的比例數(shù)量以及活化水平變化,同時(shí)檢測(cè)肝臟γδT細(xì)胞的表面分子包括 CD25、CD28、CD30、CD44的表達(dá),通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè) MHV-3感染前后肝臟γδT細(xì)胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、IFN-γ、TNF-α、穿孔素(perforin)、顆粒酶(granzyme B)等細(xì)胞因子譜的水平,檢測(cè)γδT細(xì)胞表面α-Galcer二聚體來鑒定γδT細(xì)胞是否為傳統(tǒng)的NKT細(xì)胞。
　

14、　6.磁珠分選肝臟γδT細(xì)胞,原位灌流膠原酶消化法分離小鼠原代肝細(xì)胞,利用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝臟γδT細(xì)胞在體外對(duì)原代肝細(xì)胞的殺傷作用,體外使用單克隆抗體阻斷 IFN-γ、TNF-α來驗(yàn)證肝臟γδT細(xì)胞損傷肝細(xì)胞的主要分子途徑。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.MHV-3感染 BALB/cJ小鼠后,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),肝臟組織病理學(xué)首先出現(xiàn)肝細(xì)胞嗜酸性變以及氣球樣變,形成點(diǎn)狀和局灶狀壞死,伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),最后出現(xiàn)大面積肝細(xì)胞破

15、壞,網(wǎng)織纖維塌陷等改變。同時(shí) BALB/cJ小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶 ALT、AST水平顯著升高,在感染后72h時(shí)分別達(dá)到最高值(9418.7±23.6 IU/L,8195.3±224.0 IU/L)。
　　2.通過免疫共聚焦法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟 DN T細(xì)胞高表達(dá) mfgl2,與前期 real-time PCR和western blot的檢測(cè)結(jié)果相一致。mfgl2集中在 DN T細(xì)胞膜上表達(dá),初步證實(shí)為

16、跨模型 mfgl2。另外體外促凝活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示這群表達(dá) mfgl2的DN T細(xì)胞在體外具有 PCA活性(0h為30.30±52.48 mU/ml,48h為651.51±301.80 mU/ml),進(jìn)一步驗(yàn)證該 mfgl2分子為傳統(tǒng)跨模型mfgl2.
　　3.BALB/cJ小鼠體內(nèi)使用特異性針對(duì) mfgl2的microRNA腺病毒可有效干擾肝內(nèi)mfgl2分子及蛋白水平的表達(dá),使生存率提高至33.3％,同時(shí)顯著改善肝臟組織病理學(xué)

17、改變,降低血清 ALT、AST水平,在這種情況下,尾靜脈高壓注射 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾臟 DN T細(xì)胞會(huì)逆轉(zhuǎn) mfgl2 microRNA的干擾作用,導(dǎo)致肝內(nèi) mfgl2表達(dá)水平升高,發(fā)生明顯肝組織病理學(xué)改變,血清 ALT、AST水平顯著升高,小鼠全部死亡。
　　4.尾靜脈過繼 MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠體內(nèi)分離的DN T細(xì)胞后24h,小鼠肝臟內(nèi) NK細(xì)胞表達(dá) CD69的水平顯著升高,出現(xiàn)明顯活

18、化。將肝臟 DN T細(xì)胞以及NK細(xì)胞體外共培養(yǎng)12h,DN T細(xì)胞可促進(jìn) NK細(xì)胞表達(dá) CD69比例增加,同時(shí)分泌炎性細(xì)胞因子 IFN-γ及TNF-α水平升高,NK細(xì)胞對(duì)原代肝細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MHV-3感染 BALB/cJ小鼠48h時(shí),無論在外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細(xì)胞的比例較正常時(shí)顯著升高,絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),外周血、肝臟及脾臟內(nèi)γδT細(xì)胞的總數(shù)顯著下降。肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞表

19、面高表達(dá) CD44分子,但無明顯 CD25、CD28及CD30分子的表達(dá),經(jīng)鑒別該群γδT細(xì)胞并非傳統(tǒng)的NK T細(xì)胞,同時(shí)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),γδT細(xì)胞表達(dá)活化分子CD69的比例顯著升高。對(duì)肝臟γδT細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),感染后的γδT細(xì)胞分泌 IFN-γ及TNF-α水平明顯增加,其他細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、perforin、granzyme B無明顯表達(dá)。
　　6.通過 LDH釋放殺

20、傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MHV-3感染 BALB/cJ小鼠48h肝臟內(nèi)分離的γδT細(xì)胞對(duì)感染的原代肝細(xì)胞隨著效靶細(xì)胞比例的升高其體外殺傷作用明顯增強(qiáng),單用或合用IFN-γ及TNF-α的單克隆阻斷性抗體,可顯著降低γδT細(xì)胞對(duì)原代肝細(xì)胞的殺傷作用,以 TNF-α阻斷后的效果更明顯。
　　結(jié)論:
　　1.本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果更深入探討了DN T細(xì)胞通過高表達(dá)膜型 mfgl2分子,促進(jìn)免疫凝血的作用,導(dǎo)致大量肝細(xì)胞的炎性壞死,最終誘導(dǎo)了

21、暴發(fā)型病毒性肝炎的發(fā)生。
　　2.DN T細(xì)胞體內(nèi)及體外均可促進(jìn) NK細(xì)胞的活化,并誘導(dǎo) NK細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子,增強(qiáng) NK細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的殺傷作用,可能為 DN T細(xì)胞促進(jìn)暴發(fā)型小鼠肝炎的發(fā)生的另一條途徑。以上兩個(gè)方面的研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù),亦為臨床上暴發(fā)型病毒性肝炎的免疫學(xué)治療提供了重要的靶點(diǎn)。
　　3.γδT細(xì)胞在 MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,其比例在感染后顯著