ATF6在小鼠胚胎植入期子宮和卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中的作用研究.pdf

1、Activating transcription factor6(ATF6)是一個位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。ATF6作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個主要壓力感受器(Stress Sensor)蛋白，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，它能夠與相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)基因元件協(xié)同而調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成與降解。ATF6廣泛表達(dá)于機(jī)體的多種組織、器官和細(xì)胞中，如胎盤、子宮的蛻膜組織、肝臟、心臟、胎兒成纖維細(xì)胞和RAW264

2、.7巨噬細(xì)胞等?，F(xiàn)有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)基因在哺乳動物的早期胚胎植入、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化和卵巢功能的維持與發(fā)揮等一系列生殖過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。因而，進(jìn)一步深入揭示ATF6及其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在雌性哺乳動物生殖過程中的作用，對于全面認(rèn)識哺乳動物生殖調(diào)控的分子機(jī)制、探尋調(diào)控動物繁殖的新靶點具有重要價值。
　　本研究以小鼠為模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、qRT-PCR、Western blott

3、ing、shRNA干擾、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL等技術(shù)和方法，對內(nèi)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因ATF6在小鼠胚胎植入時期的子宮和卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中的功能與作用進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、qRT-PCR和Western blotting方法，研究了ATF6在雌性小鼠發(fā)情周期不同階段的卵巢、輸卵管以及子宮中的表達(dá)模式和特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF6的mRNA和蛋白表達(dá)水平在小鼠發(fā)情周期不同階段的卵巢、輸卵管和子宮中呈現(xiàn)一定的

4、規(guī)律性。ATF6蛋白的表達(dá)主要定位于卵巢的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞，輸卵管的腔上皮細(xì)胞和子宮的腔上皮細(xì)胞與腺上皮細(xì)胞中。在卵巢、輸卵管和子宮中，ATF6的mRNA和蛋白表達(dá)水平在發(fā)情前期與發(fā)情期處于相對較低的水平，從發(fā)情后期至間情期逐漸升高，提示ATF6可能參與了雌性小鼠的生殖過程，ATF6的表達(dá)可能受到卵巢中P4和E2的影響。
　　2.研究了ATF6在小鼠早期正常妊娠、假孕、延遲著床與著床激活、人工誘導(dǎo)子宮蛻膜化、類固醇激素

5、誘導(dǎo)與拮抗劑處理等子宮中的表達(dá)與定位特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF6的mRNA和蛋白表達(dá)水平在正常妊娠第5d植入“窗口期”的子宮中顯著升高，ATF6蛋白在植入位點附近的腔上皮和基質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá);ATF6在假孕第5d子宮中的表達(dá)量顯著降低;ATF6的mRNA和蛋白在著床激活模型子宮中的表達(dá)量顯著高于對照組，ATF6蛋白在著床激活模型子宮中植入位點附近的基質(zhì)細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，推測ATF6可能參與了早期胚胎的黏附與植入過程，胚胎的存在可

6、能影響ATF6的表達(dá)。
　　ATF6的mRNA和蛋白在正常妊娠第6～8d子宮中的表達(dá)水平逐漸上升，在妊娠第6d的初級蛻膜區(qū)(PDZ)中檢測到了ATF6蛋白，ATF6高表達(dá)于妊娠7～8d的次級蛻膜區(qū)(SDZ);并且在人工誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中，ATF6的表達(dá)量顯著高于對照組，推測ATF6可能參與了早期妊娠子宮中基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化及蛻膜區(qū)的形成過程。
　　在類固醇激素與相應(yīng)拮抗劑處理模型子宮中的腔上皮、腺上皮細(xì)胞中檢測到了ATF6蛋

7、白的表達(dá)。與對照組即未經(jīng)處理的子宮相比，ATF6的mRNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，推測ATF6在子宮中的表達(dá)受到P4和E2的共同調(diào)節(jié)。
　　3.應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了針對小鼠ATF6基因的shRNA干擾重組慢病毒載體，并對其干擾效率進(jìn)行了相關(guān)檢測與驗證。結(jié)果顯示包裝獲得的ATF6基因重組干擾慢病毒的滴度約為7×107TU/mL，對小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的感染效率達(dá)到90％以上。同時，篩選出了

8、能夠有效抑制ATF6基因表達(dá)的慢病毒干擾載體，其在小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中的干擾效率在80％左右，可以滿足對ATF6基因生物學(xué)功能進(jìn)行實驗研究的要求。
　　4.研究了ATF6在性成熟小鼠不同發(fā)育階段的卵泡和體外原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF6廣泛表達(dá)于性成熟小鼠卵泡不同生長發(fā)育時期的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，ATF6在顆粒細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平受到FSH/LH的調(diào)節(jié)。
　　應(yīng)用針對小鼠ATF6基因的干擾慢病毒

9、感染了體外原代培養(yǎng)的小鼠顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)shATF6干擾慢病毒能夠有效抑制ATF6基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，干擾效率在80％左右。應(yīng)用qRT-PCR、Western blotting、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法，對抑制了ATF6基因表達(dá)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，抑制ATF6基因的表達(dá)能夠通過下調(diào)p53、Caspase-3、Chop和上調(diào)Bcl-2與Grp78等凋亡調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)水平而抑制顆粒細(xì)胞的凋亡;能夠通過抑制Cyclin A1、

10、Cyclin B1和Cyclin D2等細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)干擾顆粒細(xì)胞的正常細(xì)胞周期分布;并且能夠通過上調(diào)Cyp11a1、Star、Cyp19a1和下調(diào)Cyp1b1等類固醇激素分泌調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，而促進(jìn)孕酮和雌激素在顆粒細(xì)胞中的分泌;還能夠?qū)εc卵泡生長發(fā)育相關(guān)的功能性基因Has2、Ptgs2、Ptgfr和Igfbp4等在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。
　　5.應(yīng)用CCK-8法和Western blotting研究了赤霉

11、烯酮對小鼠顆粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)赤霉烯酮能夠顯著抑制小鼠顆粒細(xì)胞的活力，呈現(xiàn)出一定的濃度與時間依賴性的特點，并且赤霉烯酮能夠影響ATF6在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。
　　應(yīng)用qRT-PCR、Western blotting、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法，研究了ATF6在赤霉烯酮誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡過程中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制ATF6的表達(dá)能夠通過下調(diào)p53、Caspase-3、Bax和上調(diào)Bcl-2等凋亡調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)而抑制赤霉烯酮誘

12、導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡;能夠通過上調(diào)Hsd3b2和Cyp19a1等類固醇激素合成調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)而緩解赤霉烯酮誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞中P4和E2的分泌功能障礙;但抑制ATF6對赤霉烯酮引起的顆粒細(xì)胞周期阻滯無顯著影響。
　　在赤霉烯酮誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的過程中，赤霉烯酮能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)ATF6、GRP78和CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在顆粒細(xì)胞中的表達(dá);抑制ATF6能夠通過上調(diào)GRP78和下調(diào)CHOP的表達(dá)水平而降低細(xì)胞的凋亡率;并