ATF6在小鼠胚胎植入期子宮和卵巢顆粒細胞凋亡過程中的作用研究.pdf

1、Activating transcription factor6(ATF6)是一個位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。ATF6作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號轉(zhuǎn)導通路中的一個主要壓力感受器(Stress Sensor)蛋白，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，它能夠與相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激響應基因元件協(xié)同而調(diào)節(jié)細胞中蛋白質(zhì)的合成與降解。ATF6廣泛表達于機體的多種組織、器官和細胞中，如胎盤、子宮的蛻膜組織、肝臟、心臟、胎兒成纖維細胞和RAW264

2、.7巨噬細胞等?，F(xiàn)有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其信號轉(zhuǎn)導通路中的相關基因在哺乳動物的早期胚胎植入、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化和卵巢功能的維持與發(fā)揮等一系列生殖過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。因而，進一步深入揭示ATF6及其介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路在雌性哺乳動物生殖過程中的作用，對于全面認識哺乳動物生殖調(diào)控的分子機制、探尋調(diào)控動物繁殖的新靶點具有重要價值。
　　本研究以小鼠為模型，應用免疫組織化學染色、qRT-PCR、Western blott

3、ing、shRNA干擾、流式細胞術和TUNEL等技術和方法，對內(nèi)網(wǎng)應激相關基因ATF6在小鼠胚胎植入時期的子宮和卵巢顆粒細胞凋亡過程中的功能與作用進行了研究，主要結果如下:
　　1.應用免疫組織化學染色、qRT-PCR和Western blotting方法，研究了ATF6在雌性小鼠發(fā)情周期不同階段的卵巢、輸卵管以及子宮中的表達模式和特點。結果發(fā)現(xiàn)ATF6的mRNA和蛋白表達水平在小鼠發(fā)情周期不同階段的卵巢、輸卵管和子宮中呈現(xiàn)一定的

4、規(guī)律性。ATF6蛋白的表達主要定位于卵巢的卵母細胞、顆粒細胞和黃體細胞，輸卵管的腔上皮細胞和子宮的腔上皮細胞與腺上皮細胞中。在卵巢、輸卵管和子宮中，ATF6的mRNA和蛋白表達水平在發(fā)情前期與發(fā)情期處于相對較低的水平，從發(fā)情后期至間情期逐漸升高，提示ATF6可能參與了雌性小鼠的生殖過程，ATF6的表達可能受到卵巢中P4和E2的影響。
　　2.研究了ATF6在小鼠早期正常妊娠、假孕、延遲著床與著床激活、人工誘導子宮蛻膜化、類固醇激素

5、誘導與拮抗劑處理等子宮中的表達與定位特點。結果發(fā)現(xiàn)ATF6的mRNA和蛋白表達水平在正常妊娠第5d植入“窗口期”的子宮中顯著升高，ATF6蛋白在植入位點附近的腔上皮和基質(zhì)細胞中呈現(xiàn)高表達;ATF6在假孕第5d子宮中的表達量顯著降低;ATF6的mRNA和蛋白在著床激活模型子宮中的表達量顯著高于對照組，ATF6蛋白在著床激活模型子宮中植入位點附近的基質(zhì)細胞、腔上皮細胞中呈現(xiàn)高表達，推測ATF6可能參與了早期胚胎的黏附與植入過程，胚胎的存在可

6、能影響ATF6的表達。
　　ATF6的mRNA和蛋白在正常妊娠第6～8d子宮中的表達水平逐漸上升，在妊娠第6d的初級蛻膜區(qū)(PDZ)中檢測到了ATF6蛋白，ATF6高表達于妊娠7～8d的次級蛻膜區(qū)(SDZ);并且在人工誘導蛻膜化模型子宮中，ATF6的表達量顯著高于對照組，推測ATF6可能參與了早期妊娠子宮中基質(zhì)細胞的蛻膜化及蛻膜區(qū)的形成過程。
　　在類固醇激素與相應拮抗劑處理模型子宮中的腔上皮、腺上皮細胞中檢測到了ATF6蛋

7、白的表達。與對照組即未經(jīng)處理的子宮相比，ATF6的mRNA和蛋白表達水平發(fā)生了顯著變化，推測ATF6在子宮中的表達受到P4和E2的共同調(diào)節(jié)。
　　3.應用慢病毒載體介導的shRNA干擾技術，成功構建了針對小鼠ATF6基因的shRNA干擾重組慢病毒載體，并對其干擾效率進行了相關檢測與驗證。結果顯示包裝獲得的ATF6基因重組干擾慢病毒的滴度約為7×107TU/mL，對小鼠RAW264.7巨噬細胞的感染效率達到90％以上。同時，篩選出了

8、能夠有效抑制ATF6基因表達的慢病毒干擾載體，其在小鼠RAW264.7巨噬細胞中的干擾效率在80％左右，可以滿足對ATF6基因生物學功能進行實驗研究的要求。
　　4.研究了ATF6在性成熟小鼠不同發(fā)育階段的卵泡和體外原代培養(yǎng)的顆粒細胞中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)ATF6廣泛表達于性成熟小鼠卵泡不同生長發(fā)育時期的卵母細胞和顆粒細胞中，ATF6在顆粒細胞中的蛋白表達水平受到FSH/LH的調(diào)節(jié)。
　　應用針對小鼠ATF6基因的干擾慢病毒

9、感染了體外原代培養(yǎng)的小鼠顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)shATF6干擾慢病毒能夠有效抑制ATF6基因在顆粒細胞中的表達，干擾效率在80％左右。應用qRT-PCR、Western blotting、流式細胞術和ELISA等方法，對抑制了ATF6基因表達的顆粒細胞進行檢測后發(fā)現(xiàn)，抑制ATF6基因的表達能夠通過下調(diào)p53、Caspase-3、Chop和上調(diào)Bcl-2與Grp78等凋亡調(diào)控關鍵基因的表達水平而抑制顆粒細胞的凋亡;能夠通過抑制Cyclin A1、

10、Cyclin B1和Cyclin D2等細胞周期調(diào)控關鍵基因的表達干擾顆粒細胞的正常細胞周期分布;并且能夠通過上調(diào)Cyp11a1、Star、Cyp19a1和下調(diào)Cyp1b1等類固醇激素分泌調(diào)控關鍵基因的表達，而促進孕酮和雌激素在顆粒細胞中的分泌;還能夠?qū)εc卵泡生長發(fā)育相關的功能性基因Has2、Ptgs2、Ptgfr和Igfbp4等在顆粒細胞中的表達產(chǎn)生顯著影響。
　　5.應用CCK-8法和Western blotting研究了赤霉

11、烯酮對小鼠顆粒細胞的細胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)赤霉烯酮能夠顯著抑制小鼠顆粒細胞的活力，呈現(xiàn)出一定的濃度與時間依賴性的特點，并且赤霉烯酮能夠影響ATF6在顆粒細胞中的表達。
　　應用qRT-PCR、Western blotting、流式細胞術和ELISA等方法，研究了ATF6在赤霉烯酮誘導小鼠顆粒細胞凋亡過程中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制ATF6的表達能夠通過下調(diào)p53、Caspase-3、Bax和上調(diào)Bcl-2等凋亡調(diào)控關鍵基因的表達而抑制赤霉烯酮誘

12、導的顆粒細胞凋亡;能夠通過上調(diào)Hsd3b2和Cyp19a1等類固醇激素合成調(diào)控關鍵基因的表達而緩解赤霉烯酮誘導的顆粒細胞中P4和E2的分泌功能障礙;但抑制ATF6對赤霉烯酮引起的顆粒細胞周期阻滯無顯著影響。
　　在赤霉烯酮誘導小鼠顆粒細胞凋亡的過程中，赤霉烯酮能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，促進ATF6、GRP78和CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白在顆粒細胞中的表達;抑制ATF6能夠通過上調(diào)GRP78和下調(diào)CHOP的表達水平而降低細胞的凋亡率;并