ROR2在白血病中作用機制及轉(zhuǎn)基因工具在血液系統(tǒng)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　ROR2是Wnt非經(jīng)典通路的重要受體,在進化過程中高度保守,在胚胎生長發(fā)育和成體機能維持中發(fā)揮了重要作用,ROR2突變沉默個體會產(chǎn)生普遍性肢體、脊柱、面部等骨骼發(fā)育不良。有研究表明:ROR2在多種腫瘤中的表達情況和發(fā)揮的功能均不同。在有些腫瘤中,ROR2介導(dǎo) Wnt非經(jīng)典通路,拮抗 Wnt經(jīng)典通路,發(fā)揮抑癌因子作用,如在結(jié)直腸癌;但在有些腫瘤中,ROR2介導(dǎo)Wnt經(jīng)典通路,發(fā)揮致癌作用,如在黑色素瘤。
　　近年來

2、,國外和我們的研究發(fā)現(xiàn),Wnt5a在白血病中的抑癌作用可能是由ROR2介導(dǎo)完成的。前期研究中發(fā)現(xiàn),Wnt5a啟動子異常甲基化現(xiàn)象普遍存在于在多種白血病病例中,治療緩解后,Wnt5a表達恢復(fù),表明Wnt5a在白血病中可能具有抑癌作用。Wnt5a能夠抑制β-catenin及下游靶基因表達,從而增強慢粒細胞株對伊馬替尼的敏感性。我們在機制研究中還發(fā)現(xiàn),外源性Wnt5a能夠上調(diào)K562細胞中ROR2受體表達并與之結(jié)合,進而抑制 TCF/LEF轉(zhuǎn)

3、錄活性和其下游靶基因 cyclinD1表達,提示W(wǎng)nt5a是通過Wnt5a/ROR2轉(zhuǎn)導(dǎo)信號、拮抗?-catenin的作用,抑制Wnt經(jīng)典信號途徑,發(fā)揮抑癌功能。但ROR2在白血病中能夠發(fā)揮怎樣的功能,是否也能對骨髓間充質(zhì)干細胞、造血微環(huán)境產(chǎn)生影響?目前國內(nèi)外還未見報道。本研究以慢性粒細胞白血病細胞株K562為模型,采用Westernblot、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光和RNA干擾等技術(shù),構(gòu)建了多個質(zhì)粒表達系統(tǒng)和改良腺病毒感染技術(shù)

4、,并圍繞ROR2在白血病細胞和間充質(zhì)干細胞為主的微環(huán)境中發(fā)揮抑癌作用的效應(yīng)和機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn)ROR2在白血病中能夠發(fā)揮腫瘤抑制作用,其機制包括形成周期阻滯抑制腫瘤增殖,通過激活非經(jīng)典 Wnt信號:JNK通路,啟動凋亡信號,促進腫瘤細胞凋亡;ROR2能夠誘導(dǎo)K562細胞凋亡,其抑癌作用與Wnt5a的抑癌作用有區(qū)別;ROR2可作用于骨髓微環(huán)境中主要成分——間充質(zhì)干細胞,影響其細胞因子的分泌,調(diào)控其與白血病細胞間的相互作用。
　　

5、近年來,PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的研究不斷完善和進步,具備了諸多優(yōu)勢,已成為哺乳動物細胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)中備受關(guān)注的技術(shù)之一。我們利用這一系統(tǒng),構(gòu)建了多個基因表達載體和改造細胞,為研究提供了有力技術(shù)支持。其次,PB系統(tǒng)以往多用于基因表達體系的構(gòu)建,罕見用于基因的穩(wěn)定沉默、敲降系統(tǒng),我們利用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)設(shè)計并構(gòu)建了一種穩(wěn)定基因沉默系統(tǒng),并在間充質(zhì)干細胞中進行了效應(yīng)驗證,為PB轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用拓展了新的方向,為基因功能研究提供了良好的工具

6、。我們以往研究發(fā)現(xiàn):用腺病毒作載體向白血病細胞中轉(zhuǎn)基因時,腺病毒感染效率極低。本研究中,我們通過改進技術(shù),改良腺病毒感染體系,顯著提高了腺病毒感染效率,為研究提供了可靠保證,也提高了腺病毒系統(tǒng)在更多研究中的適用性。
　　總之,該研究在前期工作基礎(chǔ)上,進一步探討了 Wnt非經(jīng)典途徑的重要受體ROR2在慢性粒細胞白血病中可能具有的抑癌效應(yīng)和作用機制,研究的結(jié)果有望豐富Wnt信號與腫瘤發(fā)生的相關(guān)理論,為尋找白血病治療靶點、研發(fā)抗白血病的

7、非細胞毒性藥物或小分子化合物提供有力的科學依據(jù)。
　　方法：
　　1. ROR2在白血病中的表達和作用機制研究
　　1.1 Westernblot和免疫組化法檢測臨床病例中ROR2的表達
　　1.2分子克隆技術(shù)構(gòu)建ROR2表達質(zhì)粒和AdROR2腺病毒表達體系
　　1.3流式細胞術(shù)、熒光素酶報告實驗、ALP染色、熒光計數(shù)法證實 Polybrene的聯(lián)用與腺病毒感染效率的關(guān)系
　　1.4 CCK-8法檢測

8、ROR2對白血病細胞K562的增殖影響
　　1.5流式細胞術(shù)檢測ROR2對K562細胞周期的影響
　　1.6 Westernblot檢測ROR2對K562細胞JNK通路和MMP9蛋白表達的影響
　　1.7 AnnexinV-EGFP、PI和Hoechst33342聯(lián)用法檢測ROR2、Wnt5a對K562細胞凋亡的影響
　　1.8動物實驗觀察ROR2在K562細胞中抑癌作用的體內(nèi)效應(yīng)
　　2.間充質(zhì)干細胞高表

9、達ROR2對K562細胞的作用
　　2.1構(gòu)建穩(wěn)定高表達ROR2的iMEFs間充質(zhì)干細胞iMEFs-ROR2-luc及對照株
　　2.2構(gòu)建穩(wěn)定表達RFP的K562-RFP細胞株
　　2.3構(gòu)建非接觸共培養(yǎng)體系和接觸培養(yǎng)體系
　　2.4熒光計數(shù)和形態(tài)學觀察高表達ROR2后K562細胞的變化
　　2.5流式細胞術(shù)檢測K562細胞在共培養(yǎng)體系中的增殖情況
　　2.6 RT-PCR法檢測高表達ROR2后對i

10、MEFs細胞基因表達的影響
　　3. PiggyBac系統(tǒng)構(gòu)建的穩(wěn)定敲降系統(tǒng)pMPBOS在間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用
　　3.1以PiggyBac系統(tǒng)為載體,利用分子克隆手段,構(gòu)建pMPBOS系統(tǒng)
　　3.2以pMPBOS系統(tǒng)為基礎(chǔ),利用分子克隆手段連入小鼠?-catenin siRNA序列,構(gòu)建穩(wěn)定敲降?-catenin的pMPBOS-?-catenin體系,并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建穩(wěn)定敲降?-catenin的間充質(zhì)干細

11、胞iMEFs-KDn
　　3.3熒光素酶報告實驗、ALP相對活性測定、RT-PCR、免疫熒光等方法證明pMPBOS的穩(wěn)定性和有效性
　　結(jié)果：
　　1.急/慢性白血病初診病人骨髓中ROR2低表達或不表達,治療達完全緩解的病人ROR2表達升高。
　　2.與對照株相比,穩(wěn)定高表達ROR2的K562細胞 K562-ROR2-luc無法正常生長,提示ROR2對白血病細胞生長有抑制作用。
　　3.外源性高表達的ROR

12、2能夠抑制K562細胞增殖,將細胞阻滯在G2期,增加細胞凋亡率。
　　4.外源性ROR2能夠激活K562細胞的JNK途徑磷酸化,激活凋亡信號。
　　5.間充質(zhì)干細胞iMEFs與K562細胞接觸共培養(yǎng),能夠促進細胞發(fā)生形變、遷移進入間充質(zhì)細胞間隙。
　　6.高表達ROR2的微環(huán)境能夠減少K562細胞發(fā)生形變、進入間隙的比例。
　　7.外源性高表達ROR2改變了iMEFs細胞中c-Jun,CTGF,Pecam-1,L

13、-selectin, E-Cadherin,LIF,Vcam-1和FOXO-1的mRNA表達水平,從而改變間充質(zhì)干細胞和白血病細胞之間的相互作用。
　　8.在與Polybrene聯(lián)用條件下,C2C12細胞株和iMEFs細胞株的腺病毒感染率在一定范圍內(nèi)存在劑量依賴現(xiàn)象。
　　9. Polybrene能夠顯著增強AdBMP9腺病毒在iMEFs中的成骨效應(yīng)。
　　10.聯(lián)用Polybrene能夠顯著提高腺病毒在K562細胞中

14、的感染效率。
　　11.構(gòu)建了以PiggyBac系統(tǒng)為基礎(chǔ)的pMPBOS穩(wěn)定敲降轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),能夠?qū)崿F(xiàn)單基因或多基因的一步法穩(wěn)定敲降。
　　12.構(gòu)建了穩(wěn)定敲降小鼠β-catenin的表達質(zhì)粒pMPB-β-catenin,并利用該質(zhì)粒構(gòu)建了穩(wěn)定敲降β-catenin的iMEFs細胞(iMEFs-KDn)。
　　13.細胞實驗證實,pMPBOS系統(tǒng)存在量效依賴關(guān)系,且能夠影響β-catenin下游信號通路和遠期生物學效應(yīng)。

15、
　　結(jié)論：
　　1. ROR2在白血病病人骨髓中低表達或不表達,在治療緩解后表達升高;ROR2穩(wěn)定表達的K562不能正常增殖或存活,提示ROR2對K562細胞有抑癌效應(yīng);ROR2能夠抑制K562在體內(nèi)和體外的增殖,將其阻滯在G2期,并誘導(dǎo)該細胞凋亡,其機制可能與ROR2促進了p-JNK1/2表達,激活了JNK途徑,啟動了凋亡信號有關(guān),促凋亡效果優(yōu)于Wnt5a;
　　2.高表達ROR2的接觸共培養(yǎng)體系中,白血病細胞遷移

16、入iMEFs細胞間隙的數(shù)量減少,細胞間粘附作用減弱,不能形成致密的混合細胞微球,而是形成松散、彌漫纖細的“帶狀”克隆。ROR2改變了 iMEFs細胞中與粘附相關(guān)的部分基因表達,如下調(diào)了Pecam-1、L-selectin、E-Cadherin、LIF、Vcam-1和FOXO-1,上調(diào)了c-Jun和CTGF基因表達。提示ROR2可能通過調(diào)控iMEFs細胞的粘附功能,使白血病細胞定植能力降低,具體的機制有待進一步研究。
　　3.陽離子

17、聚合物凝聚胺,即 Polybrene,是一種安全、有效、價廉物美的增效劑,通過優(yōu)化技術(shù)方案,將之應(yīng)用于腺病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng),有效提高了感染效率,特別是對常規(guī)方法轉(zhuǎn)基因不佳的血液細胞,明顯提高了其轉(zhuǎn)基因效率,簡便易行,效果顯著。
　　4.基于PiggyBac系統(tǒng)構(gòu)建的 pMPBOS系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)長期、高效的穩(wěn)定敲降目的基因的功能,通過構(gòu)建穩(wěn)定細胞株實現(xiàn)單基因或多基因的一步法穩(wěn)定敲降,在間充質(zhì)干細胞iMEFs中有效敲降了Wnt關(guān)鍵分子?-c