Culin-5表達下調(diào)對足細胞形態(tài)及增殖功能的初步影響.pdf

1、背景：腎小球性蛋白尿發(fā)生的根本原因是由于腎小球濾過屏障受損,而腎小球上皮細胞則是保持腎小球濾過膜功能完整的關(guān)鍵因素。近十余年來的眾多研究發(fā)現(xiàn),很多先天性腎病綜合征患者的發(fā)病是由于Nephrin、Podocin、α-Actinin-4、Synaptopodin、WT-1等蛋白質(zhì)的編碼基因突變引起的。上述基因Knock-out的模型動物也出現(xiàn)了蛋白尿及腎小球上皮細胞足突融合等病變,表明這些表達在腎小球上皮細胞的足突分子(如Nephrin、P

2、odocin、CD2AP、TRPC6)及細胞骨架相關(guān)蛋白(如Synaptopodin、α-Actinin-4、Podocalyxin等)對維持腎小球濾過膜完整性、阻止血漿蛋白漏出起著重要作用。本研究小組近年來的研究也發(fā)現(xiàn),Nephrin、Podocin、CD2AP等足突分子的表達及調(diào)控變化確實與部分中國原發(fā)性腎病綜合征患兒的發(fā)病密切相關(guān)。同時我們還證實,Myole(一種肌球蛋白Ⅰ類分子)也是人、小鼠腎小球上皮細胞的骨架相關(guān)蛋白,其表達K

3、nock-down后斑馬魚可出現(xiàn)蛋白尿及腎小球上皮細胞結(jié)構(gòu)變化。所有細胞的蛋白質(zhì)都需要代謝和更新,真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)和降解主要有兩個途徑:溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UbiquitinProteasome System,UPS)。UPS由泛素、26S蛋白酶體、泛素活化酶E1s、泛素交聯(lián)酶E2s、泛素連接酶E3s等組成,是高效、特異的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),是細胞調(diào)控特定蛋白質(zhì)、去除錯誤折疊蛋白的主要機制。泛素連接酶E3s的主要作用是識別

4、特定的需要被降解的靶蛋白,并把泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上,最后通過蛋白酶降解靶蛋白。Cullin-5(CUL5)是很多E3s-CRL的組分,參與多種靶蛋白(如p53)的降解。其編碼基因(位于11q22-23)序列與精氨酸加壓素激活鈣轉(zhuǎn)運受體-1(VACM-1)高度同源,所以這兩者可能是同一種蛋白。迄今為止,已知CUL5／VACM-1的功能是：CUL5作為Backbone組裝E3s,參與真核細胞胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)的泛素化修飾及特異性降解；作為主要表達

5、在血管內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì),VACM-1在多個細胞株都表達出抑制細胞增殖的活性,具抗腫瘤效應(yīng)。我們的前期研究表明,CUL5在人、小鼠腎小球上皮細胞有表達,其表達下調(diào)可導(dǎo)致模式動物斑馬魚出現(xiàn)蛋白尿。我們分析,CUL5表達下調(diào)可導(dǎo)致蛋白尿的機制可能與由此導(dǎo)致的以CUL5為基石的UPS功能異常,并最終引起足突分子及細胞骨架相關(guān)蛋白的代謝、轉(zhuǎn)換和更新機制失調(diào)有關(guān)。
　　 目的：研究CUL5敲低之后,小鼠的腎小球足細胞的形態(tài)和增殖的變化。闡明

6、CUL5在維持足突分子和腎小球濾過屏障的功能中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
　　 方法：⑴小鼠腎小球足細胞培養(yǎng)。⑵細胞免疫熒光法鑒定足細胞及細胞骨架蛋白。⑶miRNA設(shè)計,針對CUL5的4個不同序列,分別設(shè)計四個質(zhì)粒和一個陰性對照質(zhì)粒。由Invitrogen公司合成。⑷使用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑,對足細胞中的CUL5基因瞬時轉(zhuǎn)染,敲低CUL5表達。⑸應(yīng)用RT-PCR方法來從mRNA水平,檢測基因敲低的效果,以GAPDH作為內(nèi)

7、參基因,經(jīng)過Geo-plo-Analyzer4.0軟件,分析凝膠電泳后圖片,半定量分析基因表達差異。⑹應(yīng)用Western—blot方法從蛋白水平,檢測基因敲低的效果,以β-actin作為內(nèi)參基因,經(jīng)過Image J軟件分析,半定量分析蛋白表達的差異。⑺細胞免疫熒光法檢測CUL5敲低之后足細胞形態(tài)學的變化。⑻細胞免疫熒光法檢測CUL5敲低之后細胞骨架蛋白的變化。⑼MTT法檢測各個實驗組細胞的增殖情況,分別設(shè)定4個實驗點,即24小時、48小

8、時、72小時、96小時,檢測細胞的OD值。
　　 結(jié)果：①小鼠足細胞,在33℃允許條件(permissive condition)下,增殖狀態(tài)下的足細胞呈“鵝卵石”樣。胞核呈圓形,位于胞體中央,足突較少較短；在轉(zhuǎn)入37℃非允許條件(non-permissive condition)下,培養(yǎng)約14天的時間,足細胞分化成熟,胞質(zhì)向四周伸展,形狀不規(guī)則,有大量較長較細的足突形成,細胞呈“樹枝”狀。Nephrin作為鑒定足細胞內(nèi)蛋白分子

9、。②33℃允許條件下的足細胞,CUL5分布范圍:主要集中在足細胞核膜的周圍。37℃非允許條件下的足細胞,CUL5分布在細胞的胞漿和足突處。③33℃允許條件下的足細胞,F-actin分布范圍:主要集中在足細胞主突附近；37℃非允許條件下的足細胞,F-actin呈放射狀,伸展至新生的突起中。④經(jīng)過RNAi技術(shù)后,敲低CUL5,經(jīng)過RT-PCR的檢測mRNA的相對表達變化:干擾一組(P=0.003)、二組(P=0.042)、三組(P=0.00

10、0)、四組(P=0.000)與對照組有差異P<0.05；陰性對照組與對照組無明顯差異,P=0.091。⑤敲低CUL5后,用Western-blot檢測蛋白的相對表達變化:干擾一組、二組、三組、四組與對照組有差異P<0.05;陰性對照組與對照組無明顯差異,P=0.051。⑥敲低CUL5之后,免疫熒光法檢測細胞中熒光變化的情況,各個干擾組細胞熒光強度明顯變?nèi)?而對照組和陰性對照組的熒光強度相差不大。⑦敲低CUL5之后,足細胞形態(tài)上的變化:細