曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型的影響及分子機理研究.pdf

1、曲馬多和對乙酰氨基酚均是臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥,常用于輕、中度疼痛的緩解,較少應用于神經病理性疼痛的治療,對其作用機制的研究也知之甚少；而將兩者聯合應用于神經病理性疼痛的治療,目前更是缺乏相應的實驗研究。本研究通過脊髓腰5(L5)神經的結扎橫切建立大鼠的神經病理性疼痛模型,研究了曲馬多聯合對乙酰氨基酚對大鼠機械痛覺超敏和熱痛覺過敏的影響,并從小膠質細胞及多種促/抗炎因子入手對其機制進行了初步探索。 研究一 神經病理性疼痛模型的建立和

2、相關機制的研究 一、大鼠神經病理性疼痛模型的建立以及機械、熱痛閾改變情況 從出生10～15周,體重230～280g的雄性大鼠中篩選出痛覺反應正常大鼠,按照Kim和Chung的方法通過脊髓腰5神經的結扎橫切建立神經損傷模型,術后觀察一般行為學情況,在術后第1、3、7、11、14和21天分別用von Frey法和Hargreaves法測量機械縮足反射閾值和熱縮足潛伏期。結果表明：脊神經損傷術后大鼠一般情況良好,出現了明顯的機

3、械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現,并在第3天達到高峰,證明大鼠神經病理性疼痛模型制作成功。 二、大鼠神經病理性疼痛模型相關機制的研究 (一)小膠質細胞在神經病理性疼痛大鼠脊髓的表達情況 大鼠脊神經損傷手術后第1、3、7、11、14、21天,完成機械和熱痛閾測量后,多聚甲醛灌注處死動物,取脊髓L4.5節(jié)段用免疫組化方法觀察脊髓小膠質細胞的表達活性。結果顯示：免疫標記物OX-42標記陽性的小膠質細胞在正常脊髓后角表達較少,

4、胞體較小,表面有小棘突和細長分支；手術后各時間點小膠質細胞明顯增生,且分支變粗變長,呈阿米巴樣分叉變形。通過細胞計數發(fā)現,術后小膠質細胞表達第3、7天達到高峰,隨后逐漸減少,到第21天逐漸恢復術前水平,與大鼠的痛閾改變趨勢類似。 (二)促/抗炎細胞因子在神經病理性疼痛大鼠脊髓及腦中的變化 脊神經損傷手術后第1、3、7、11、14、21天,完成機械和熱痛閾測量后,處死動物,取整段脊髓組織(頸髓至骶髓)和全腦組織,用酶聯免疫

5、吸附法(ELISA)檢測脊髓和腦組織中多種細胞因子TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(PGE2)、及白介素-10(IL-10)的表達情況。結果顯示：與正常大鼠相比,術后脊髓、腦組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和PGE2表達顯著增高,均在第3天達到最高峰(PGE2在術后第7天),變化趨勢與痛閾值變化一致；而抗炎因子IL-10的表達則在術后逐漸增加,在第21天達到最高峰。 (三)核轉錄因子NF-κB在神經病理性疼痛大鼠脊髓

6、及腦中的變化 大鼠行脊神經損傷手術后第1、3、7、11、14、21天,用凝膠電遷移法進行脊髓和腦組織核因子-κB(NF-κB)活性測定。結果顯示：與正常大鼠相比,術后脊髓和腦組織中的NF-κB表達明顯增加,并均在第3天達到最高峰,說明脊神經損傷手術可以誘導核轉錄因子NF-κB表達,并使其在整個實驗過程中均保持較高的水平。 研究二 曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型的協(xié)同治療作用 一、腹腔曲馬多聯合對乙

7、酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型協(xié)同治療作用 將制備成L5脊神經損傷術的實驗動物隨機分為10組,術后第7天腹腔分別注射對乙酰氨基酚40(Ⅰ組)、80(Ⅱ組)和160 mg/kg(Ⅲ組),曲馬多5(IV組)、10(V組)和20 mg/kg(VⅠ組),對乙酰氨基酚40 mg/kg+曲馬多5 mg/kg(VⅡ組),對乙酰氨基酚80 mg/kg+曲馬多10 mg/kg(VⅢ組),對乙酰氨基酚160 mg/kg+曲馬多20 mg/kg(I

8、X組),生理鹽水對照組(X組)。結果顯示:與生理鹽水組相比,除各對乙酰氨基酚組及曲馬多5mg/kg組外,其余各組在給藥后各時間點均能顯著提高大鼠的機械和熱痛閾值,明顯減輕機械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現；與單獨應用曲馬多相比,曲馬多聯合對乙酰氨基酚腹腔注射對脊神經部分結扎大鼠機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏具有協(xié)同的抗傷害感受性作用。 二、鞘內曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型協(xié)同治療作用 將制備成L5脊神經損傷術的實

9、驗動物隨機分為10組,術后第七天鞘內分別注射對乙酰氨基酚8ug(Ⅰ組)、40ug(Ⅱ組)和80ug(Ⅲ組),曲馬多1ug(IV組)、5ug(V組)和10 ug(VⅠ組),對乙酰氨基酚8ug+曲馬多1ug(VⅡ組),對乙酰氨基酚40ug+曲馬多5ug(VⅢ組),對乙酰氨基酚80ug+曲馬多10ug(IX組),生理鹽水對照組(X組)。結果顯示:與生理鹽水組相比,除各對乙酰氨基酚組及曲馬多1ug組外,其余各組在給藥后各時間點均能顯著提高大鼠的

10、機械和熱痛閾值,明顯減輕機械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現；與單獨應用曲馬多相比,曲馬多聯合對乙酰氨基酚鞘內注射對脊神經部分結扎大鼠機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏具有協(xié)同的抗傷害感受性作用。 研究三 曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型的影響及其相關機制的研究 一、曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型形成和建立后行為學的影響 (一)曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型形成的行為學的影響

11、 將制備成L5脊神經損傷術的實驗動物隨機分為4組,分別在手術后當天開始腹腔注射以下各組藥物,每天兩次(10:00、20:00),連續(xù)七天。(1)曲馬多20mg/kg+對乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲馬多20mg/kg、(3)對乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理鹽水。結果顯示:與生理鹽水對照組相比,單純曲馬多組和曲馬多聯合對乙酰氨基酚組均能抑制神經病理性疼痛大鼠熱痛敏和機械超敏的形成,以第3天至第7天的抑制作用最明顯,而且曲馬多

12、聯合對乙酰氨基酚組表現出的抑制作用可一直持續(xù)至21天。 (二)曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型建立后的行為學的影響 將脊神經損傷實驗動物隨機分為四組：分別在手術后第7天開始腹腔注射以下各組藥物,每天兩次(10:00、20:00),連續(xù)七天。(1)曲馬多20mg/kg+對乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲馬多20mg/kg、(3)對乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理鹽水。與生理鹽水組相比,手術后第7天開

13、始連續(xù)給與曲馬多+對乙酰氨基酚能減輕疼痛行為學表現,以術后第7天至第14天最明顯,但與假手術組相比,MWT和TWL值仍有顯著差異,而停止給藥后,曲馬多+對乙酰氨基酚組的MWT和TWL值的差異與生理鹽水組相比,差異無統(tǒng)計學意義。 二、曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中小膠質細胞表達的影響 通過免疫組化方法觀察不同給藥組L4-5節(jié)段小膠質細胞的表達情況。結果顯示：各組動物脊神經損傷術后OX-42

14、標記陽性的小膠質細胞均顯著增生,胞體肥大、分支增多呈樹叉樣,主要分布于手術側脊髓后角的灰質之中；與生理鹽水注射組相比,預先給與曲馬多聯合對乙酰氨基酚組小膠質細胞表達含量均明顯減少,以術后第7天達到最高峰,至術后21天可恢復正常,而單純曲馬多或對乙酰氨基酚對小膠質細胞表達的影響與生理鹽水組相比較差異不明顯；而與生理鹽水組相比,術后第7天開始連續(xù)給與曲馬多+對乙酰氨基酚組中小膠質細胞表達含量減少不明顯。 三、曲馬多聯合對乙酰氨基酚對

15、神經病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中促/抗炎細胞因子含量的影響 運用ELISA的方法檢測了不同給藥組大鼠在脊神經損傷術后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和腦組織的TNF-α、IL-1β、PGE2及IL-10的表達情況。結果顯示：與生理鹽水組相比,對乙酰氨基酚組、曲馬多聯合對乙酰氨基酚組均能抑制術后各時間點脊髓和腦組織中的促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2水平；并同時可顯著刺激抗炎因子IL-10的表達,在術后第11

16、天達到高峰；與生理鹽水組相比,術后第7天開始連續(xù)注射曲馬多+對乙酰氨基酚也能抑制促炎細胞因子的表達、增加抗炎細胞因子的含量,變化趨勢與大鼠機械和熱痛閾的緩解趨勢一致。 四、曲馬多聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓及腦中NF-κB的影響。檢測不同給藥組大鼠在脊神經損傷術后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和腦組織的NF-κB活性變化情況。結果顯示：與正常大鼠相比,術后生理鹽水注射組大鼠脊髓和腦中的NF-κ

17、B表達明顯增加,并在第3天達到最高峰,在第14天達到第2個小高峰；與生理鹽水組相比,預先腹腔聯合注射曲馬多+對乙酰氨基酚能顯著抑制脊髓和腦中NF-κB的活性,與大鼠的痛閾值變化趨勢類似；與生理鹽水組相比,術后第7天開始腹腔聯合注射曲馬多+對乙酰氨基酚對脊髓和腦中NF-κB活性的抑制并不明顯。 結論：本研究中通過L5脊神經損傷手術建立大鼠的神經病理性疼痛模型,研究曲馬多聯合對乙酰氨基酚對大鼠機械和熱痛覺敏感程度的影響,并檢測了與疼