LMP1基因特異性沉默對GT38細胞影響的初步研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬皰疹病毒γ亞科，是重要的DNA腫瘤病毒，與鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多種腫瘤的發(fā)生有關。在EBV編碼基因中，潛伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1，LMP1)編碼基因已被確認具有癌基因的功能。研究表明，LMP1具有介導細胞增殖、抑制細胞凋亡和細胞分化，以及促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學活性。 siRNA是一種

2、短片段雙鏈RNA分子，能以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，從而高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型。因此采用siRNA技術深入探討LMP1的生物活性對于揭示EBV致癌機制以及開展EBV相關腫瘤的特異性治療具有實際意義。 本研究選擇EBV陽性胃上皮細胞GT38作為靶細胞，采用人工合成的siRNA特異性阻斷LMP1的表達，檢測LMP1沉默對GT38增殖和凋亡的影響，探討LMP1在EBV

3、相關腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制，為EBV相關腫瘤的生物治療提供實驗依據(jù)。 目的:探討化學合成小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)對EBV陽性胃上皮細胞(GT38)LMP1編碼基因表達的抑制作用以及對細胞增殖和凋亡的影響。 方法: ①.采用脂質(zhì)體法分別以20、30、50、80和100nM終濃度熒光標記的陰性對照siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染GT38細胞，轉(zhuǎn)染12h內(nèi)用倒置熒光顯

4、微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。 ②.化學合成靶向LMP1 mRNA 649、979和1348位點的3對siRNA，以EBVⅢ型潛伏的胃上皮細胞GT38為靶細胞，采用脂質(zhì)體法分別將3組siRNA轉(zhuǎn)染GT38細胞，同時設非特異性對照和細胞對照。采用RT-PCR和Western blotting檢測靶基因LMP1的轉(zhuǎn)錄表達水平，篩選出抑制效果最為理想的siRNA鏈并檢測對LMP1表達影響的時效關系。 ③.選擇抑制效果最好的siRNA鏈以最

5、佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染靶細胞，采用Hoechst 33258、透射電鏡和流式細胞術檢測GT38細胞凋亡和周期的變化；Western blotting檢測LMP1沉默對GT38細胞、細胞漿和細胞核內(nèi)NFκB基因表達的影響；RT-PCR檢測對Bcl-2、Bax、MMP9、ICAM-1轉(zhuǎn)錄表達的影響。 結果: ①.FAM-siRNA轉(zhuǎn)染GT38細胞后12h各濃度組在熒光顯微鏡下均可觀察到細胞內(nèi)有點狀綠色熒光出現(xiàn)，表明轉(zhuǎn)染成功。siRN

6、A終濃度為50，80和100nM時轉(zhuǎn)染效率較高，本實驗選用50nM濃度siRNA轉(zhuǎn)染GT38細胞。 ②.RT-PCR檢測結果表明，與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的細胞相比，siRNA649、siRNA979和siRNA1348對靶細胞LMP1的轉(zhuǎn)錄表達均具有抑制作用，差異均有統(tǒng)計學意義(F=235.99，P<0.05)；其中以siRNA649對LMP1轉(zhuǎn)錄表達的抑制作用最為明顯，轉(zhuǎn)染后24，48和72h時LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均明

7、顯低于細胞對照組(F=89.93，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染后48和72h時LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄表達水平明顯低于轉(zhuǎn)染后24h時LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄表達水平。Western blotting結果顯示，與細胞對照比較，轉(zhuǎn)染siRNA649后48h未檢測到LMP1的表達，轉(zhuǎn)染后72和96h時LMP1的表達明顯減弱。 ③.Hochest 33258染色可見siRNA649作用后的GT38細胞發(fā)生凋亡，透射電鏡觀察到GT38細胞線粒體空泡

8、化，染色質(zhì)固縮；而轉(zhuǎn)染非特異性對照siRNA的GT38細胞未觀察到上述改變。流式細胞分析顯示，與非特異性對照組和細胞對照組比較，siRNA649作用24，72以及120h后的細胞其細胞周期無明顯改變。 ④.Western blotting結果顯示與細胞對照比較，siRNA649轉(zhuǎn)染后GT38細胞總蛋白和核蛋白中NFκB的表達水平降低，細胞漿蛋白中NFκB表達水平增高。 ⑤.RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、MMP9和C

9、AM-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達，電泳結果顯示與細胞對照比較，轉(zhuǎn)染后24，48和72h GT38細胞Bcl-2(F=39.83，P<0.05)、MMP9(F=177.47，P<0.05)、ICAM-1(F=467.69，P<0.05)的轉(zhuǎn)錄表達明顯下調(diào)，差別有統(tǒng)計學意義，對Bax的轉(zhuǎn)錄表達無明顯影響(F=0.75，P>0.05)，Bcl-2/Bax比值降低，差別有統(tǒng)計學意義(F=5.45，P<0.05)。 結論:化學合成siRNA能