miR-375過表達引起胰腺損傷的初步研究.pdf

1、microRNA（miRNA，即微小RNA），是體內(nèi)22nt的一類非編碼的RNA，由miRNA的前體經(jīng)Dicer酶的作用加工而來。在細胞的生長、增殖、代謝、調(diào)亡等方面都有著重要的作用。它可以通過與特定mRNA結(jié)合，來調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程，從而調(diào)控基因表達。目前人類基因組中已確認的miRNA有上千個，可能參與30％人類蛋白質(zhì)的表達調(diào)控。隨著許多新的miRNA及其功能的不斷發(fā)現(xiàn)，使得miRNA的研究倍受關注，成為生命科學最熱門的

2、研究之一。
　　 研究有關miRNA功能的文獻有很多，但大部分是在細胞水平的研究，而只在細胞水平研究miRNA功能是遠遠不夠的，因為miRNA功能最終還得在整個機體中發(fā)揮作用。在整體水平對miRNA功能的研究，目前國內(nèi)外都很少。miRNA在胰腺發(fā)育和功能的維持中起著
　　 非常重要的作用，miR-375是在胰腺中特異表達的miRNA之一，它的正常表達與否對胰腺的形態(tài)、發(fā)育和功能也至關重要。有關研究表明，miR-375除了

3、對MTPN表達的調(diào)控外，還對AdipoR2的表達有調(diào)控作用。為了研究miR-375是如何影響胰腺發(fā)育和胰腺的功能，探討miR-375在胰腺發(fā)育過程中的作用機理，本實驗采用顯微注射的方法，利用胰腺內(nèi)特異表達的啟動子RIP(rat insulin premptor)帶上編碼miR-375的基因，構建miR-375過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，旨在研究由miR-375過表達而引起的MTPN、AdipoR2的變化，從而引起胰腺損傷的機理。本研究共分三

4、部分，其主要的實驗方法及實驗結(jié)果如下：
　　 第一章、miR-375基因的克隆和功能的初步分析
　　 本章構建了一個含有miR-375基因序列的質(zhì)粒pAAV-MCS-miR-375，用pAAV-MCS-miR-375轉(zhuǎn)染Hela細胞48小時后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Hela細胞有miR-375前體的表達。用pAAV-MCS-miR-375轉(zhuǎn)染Nit-1細胞48小時后，Western Blot檢測miR-375過表

5、達對Nit-1細胞中MTPN蛋白表達的調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pAAV-MCS-miR-37548小時后的Nit-1細胞中MTPN的表達，與轉(zhuǎn)染pAAV-MCS和未轉(zhuǎn)染的Nit-1細胞中MTPN的表達相比有略微下調(diào)。為進一步證實miR-375對MTPN表達的作用，我們用pAAV-MCS-miR-375轉(zhuǎn)染Nit-1細胞48小時后，做免疫細胞化學分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pAAV-MCS-miR-37548小時后的Nit-1細胞中MTPN蛋白表達比

6、轉(zhuǎn)染pAAV-MCS和未轉(zhuǎn)染的Nit-1細胞中MTPN蛋白表達下調(diào)。本研究還測定了未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pAAV-MCS-miR-375和轉(zhuǎn)染pAAV-MCS的Nit-1細胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pAAV-MCS-miR-37548小時后的Nit-1細胞中胰島素的分泌比未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染pAAV-MCS的Nit-1細胞中胰島素的分泌下調(diào)。這說明我們構建的質(zhì)粒不但能生成成熟的miR-375，并且能抑制目的Mytrophin基因的表達。本實

7、驗成功的克隆了miR-375基因。所構建的表達miR-375的質(zhì)粒pAAV-MCS-miR-375在細胞中能夠表達miR-375、能夠抑制MTPN的表達使得細胞受葡萄糖刺激分泌胰島素的能力下降。
　　 第二章、轉(zhuǎn)基因小鼠的構建
　　 本實驗采用顯微注射法，利用胰腺內(nèi)特異表達的啟動子RIP(ratinsulin premptor)帶上編碼miR-375的基因和人生長激素基因的Poly(A)，構建miR-375過表達的轉(zhuǎn)基因

8、小鼠模型。通過PCR、Slot Blot、Southern Blot鑒定陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺中miR-375的表達采用RT-PCR和real-time PCR測定，轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺中myotrophin(MTPN)的表達采用real-time PCR和Western Blot測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺中成熟miR-375的表達是正常小鼠的1.15倍；轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺中myotrophin(MTPN)的表達是正常小鼠的1/7.7

9、。轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠的體重和血糖測定發(fā)現(xiàn)，與正常同類小鼠相比，雌性轉(zhuǎn)基因鼠的體重有明顯下降，雄性轉(zhuǎn)基因鼠的體重無變化，轉(zhuǎn)基因鼠的血糖無明顯變化。糖耐量實驗中雌性轉(zhuǎn)基因鼠在30～60分鐘段血糖恢復比正常小鼠快。轉(zhuǎn)基因小鼠空腹血清胰島素含量用Linco Research公司的RAT/MOUSE INSULIN ELISA KIT測定。結(jié)果顯示，與正常同類小鼠相比，雌性轉(zhuǎn)基因鼠血清胰島素含量低34.3％、有顯著差異，雄性轉(zhuǎn)基因鼠的血清胰島素

10、含量無明顯變化。在對轉(zhuǎn)基因小鼠進行細胞學檢測時，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠存在染色體數(shù)量或結(jié)構上的改變，而RT-PCR檢測與胰腺發(fā)育相關基因時發(fā)現(xiàn)，雌性轉(zhuǎn)基因小鼠縣腺中PDX-1、INS1、ISL-1、PAX6、GLK、GLG、PP的表達上升。用胰島素抗體和胰高血糖素抗體做免疫熒光發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因鼠胰腺中胰島素和胰高血糖素的合成不受影響。對轉(zhuǎn)基因鼠胰腺做病理切片HE染色發(fā)現(xiàn)，在胰腺中胰島的周圍有很多空泡，出現(xiàn)脂肪變性，另外胰腺中的胰島還顯著萎縮。對轉(zhuǎn)

11、基因鼠肺做病理H/E染色發(fā)現(xiàn)，肺中有嚴重的支氣管肺炎、支氣管壞死和中性淋巴細胞浸潤，在支氣管中有增生的現(xiàn)象。
　　 第三章、非β-細胞誘導成產(chǎn)生胰島素細胞的初步研究
　　 本章構建了表達PDX-1、Insulin的質(zhì)粒pAAV-MCS-PDX-1和pAAV-MCS-Insulin。用pAAV-MCS-PDX-1轉(zhuǎn)入293T細胞后引起了293T細胞中與胰島發(fā)育相關基因的表達或高表達，但是沒有胰島基因的表達。另外還用pAAV