18O標(biāo)記技術(shù)改良和分析工具開發(fā)及在鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)膜蛋白組研究中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域。由于基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯后產(chǎn)生蛋白質(zhì)的過程中，存在著轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平的調(diào)控，同時還存在著蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，因而蛋白質(zhì)組研究要比基因組研究復(fù)雜得多，蛋白質(zhì)組學(xué)對技術(shù)的依賴性和要求也遠(yuǎn)超過基因組學(xué)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的方法和技術(shù)一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨的挑戰(zhàn)。
　　 隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)和方法的進(jìn)步，蛋白質(zhì)組學(xué)研究呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)：即由原來以蛋

2、白質(zhì)表達(dá)譜研究為中心逐步向蛋白質(zhì)精確定量和功能研究轉(zhuǎn)變。目前以穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)為代表的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已逐漸成為了蛋白質(zhì)組研究的新技術(shù)之一。但定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還處于發(fā)展階段，其研究技術(shù)和相關(guān)分析工具有待改進(jìn)和完善。
　　 18O標(biāo)記技術(shù)是較早應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)之一。該技術(shù)以酶解反應(yīng)動力學(xué)原理為基礎(chǔ)，通過酶催化反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的18O標(biāo)記。18O標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、條件溫和、沒有副產(chǎn)物等獨(dú)特優(yōu)勢。但18O技術(shù)也存

3、在如下不足：(1)在酶存在的情況下標(biāo)記容易丟失，從而影響定量分析的準(zhǔn)確性；(2)獲得的數(shù)據(jù)分析相對復(fù)雜；
　　 (3)定量分析工具不足。
　　 膜蛋白在細(xì)胞與細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮重要功能。膜蛋白異常表達(dá)常導(dǎo)致細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附和運(yùn)動等方面的改變，并與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，膜蛋白質(zhì)組研究己成為腫瘤蛋白質(zhì)組研究的重要內(nèi)容。
　　 基于上述考慮，我們首先對18O標(biāo)記方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)。1

4、8O標(biāo)記中標(biāo)記丟失是該方法的主要的弱點(diǎn)。針對這一點(diǎn)，我們采用固相胰酶作為標(biāo)記酶，標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，通過Ziptip對固相胰酶進(jìn)行過濾去除，分析過濾后的樣本在不同pH條件下標(biāo)記的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，與熱處理法比較，Ziptip過濾法能顯著提高18O標(biāo)記的穩(wěn)定性。在連續(xù)三天的檢測中未發(fā)現(xiàn)明顯的標(biāo)記丟失現(xiàn)象。進(jìn)一步分析了Ziptip過濾法對定量分析結(jié)果的的影響，結(jié)果顯示在連續(xù)三天的檢測中肽段的定量差異均小于5％。對過濾樣品進(jìn)行等電聚焦(IEF)分

5、離后也顯示18O標(biāo)記無明顯丟失，進(jìn)一步的分析也顯示肽段標(biāo)記效率與肽段分子量和理論等電點(diǎn)無明顯相關(guān)性。另外，Ziptip過濾法所處理樣品均為10-20μl，因此，我們優(yōu)化和改進(jìn)的18O標(biāo)記方法能夠用于微量蛋白樣本的定量分析，這對臨床稀缺樣本，如激光捕獲顯微切割(LCM)純化的組織樣本的分析具有重要意義。
　　 我們針對目前18O蛋白定量分析工具不足的現(xiàn)狀開發(fā)了OxyQuantToolkit工具。該工具采用java語言開發(fā)，具有跨平

6、臺的優(yōu)勢。分析工具的功能涵蓋了18O標(biāo)記技術(shù)中數(shù)據(jù)處理的多個環(huán)節(jié)，通過該工具可自動完成18O標(biāo)記定量分析中的大量計(jì)算任務(wù)，分析工具可輸出定量分析結(jié)果。同時分析工具還具有數(shù)據(jù)整理，轉(zhuǎn)存方面的功能，這對有效管理數(shù)據(jù)也有積極作用。另外，該工具還包含了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可視化編程包，可進(jìn)行質(zhì)譜通用格式文件mzxml的可視化查看。OxyQuantToolkit分析工具的開發(fā)為基于18O標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的推廣與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 在標(biāo)記方

7、法改進(jìn)和分析工具開發(fā)的基礎(chǔ)上，我們利用改進(jìn)盼18O標(biāo)記技術(shù)對高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F與不轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞6-10B的膜蛋白組進(jìn)行了定量分析。結(jié)果共鑒定了503種蛋白質(zhì)，其中44％為膜蛋白，89.7％的蛋白質(zhì)定量結(jié)果在0.5-2之間(均值為1.13)。對重復(fù)鑒定的395個蛋白的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示其標(biāo)準(zhǔn)差均值為0.06，具有較高的重復(fù)性。結(jié)果表明，改進(jìn)的18O標(biāo)記技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。另外，參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)(差異變化兩倍以上、

8、在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均被鑒定的蛋白質(zhì))，我們對5-8F與6-10B細(xì)胞的膜蛋白組進(jìn)行了比較，獲得了31個差異表達(dá)的膜蛋白，其中在5-8F中表達(dá)下調(diào)的6個，表達(dá)上調(diào)的25個。生物信息分析顯示，其中一些差異蛋白如ITGB1、EphA2與細(xì)胞粘附、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些差異蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制以及鼻咽癌轉(zhuǎn)移的防治提供了靶標(biāo)。進(jìn)一步比較5-8F與6-10B細(xì)胞的膜磷酸化蛋白組的差異，發(fā)現(xiàn)EphA2促轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵位點(diǎn)S897磷酸化水平

9、在兩株細(xì)胞存在差異，且EGFR能夠磷酸化該位點(diǎn)，這提示EGFR可能通過活化EphA2促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移。
　　 本研究建立了基于Ziptip過濾去除固相胰酶的改良18O標(biāo)記方法。該方法具有標(biāo)記穩(wěn)定、定量分析準(zhǔn)確結(jié)果以及適合微量樣本分析的特點(diǎn)；開發(fā)了與平臺無關(guān)的基于18O標(biāo)記技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組分析工具OxyQuantToolkit，為18O標(biāo)記技術(shù)的推廣和應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，并開發(fā)了基于java的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可視化編程包，實(shí)現(xiàn)了mzxml文件