問(wèn)號(hào)鉤體外膜蛋白基因LA0301克隆、表達(dá)及其膜定位.pdf

1、鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體引起的一種人獸共患病，是我國(guó)的法定乙類(lèi)傳染病之一。我國(guó)是受鉤體病危害較嚴(yán)重的國(guó)家之一。安全有效的疫苗是防治鉤端螺旋體病的最好方法。鉤端螺旋體疫苗先后經(jīng)歷了傳統(tǒng)的全菌體疫苗、改良的濃縮疫苗和外膜疫苗時(shí)期，對(duì)防治鉤端螺旋體病作出了貢獻(xiàn)。但是它們共同的缺點(diǎn)是免疫力不夠持久，需要每年在疫區(qū)進(jìn)行免疫接種，同時(shí)都具有一定的副作用，并且對(duì)不同血清型的鉤端螺旋體不能引起交叉免疫保護(hù)，這些缺點(diǎn)限制了鉤端螺旋體疫苗的應(yīng)用?，F(xiàn)

2、在鉤端螺旋體研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一是新型疫苗的研制，其核心是尋找合適的疫苗候選基因。 鉤體外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPS）位于鉤體外膜上，參與鉤體與宿主黏附，在引起宿主免疫和致病中發(fā)揮著重要作用。因此，研究致病性鉤體膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征以及在不同鉤體菌株中的保守性,對(duì)于發(fā)展純化組分疫苗和基因工程疫苗有重要意義，是研發(fā)新疫苗的重要方向。 運(yùn)用已知的鉤體基因組序列，楊宏亮博士等運(yùn)用反向疫苗學(xué)的原理

3、，預(yù)測(cè)了226個(gè)可能成為鉤端螺旋體疫苗候選基因的膜蛋白基因，其中LA0301為預(yù)測(cè)定位于鉤端螺旋體外膜蛋白的基因。 本文首先通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了LA0301的基因特征。通過(guò)exPAsy預(yù)測(cè)其一級(jí)結(jié)構(gòu)，TMHMM預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，interproscan分析預(yù)測(cè)其保守域,并運(yùn)用blastp對(duì)LA0301蛋白在已測(cè)序的鉤體中進(jìn)行了序列比對(duì)。結(jié)果顯示LA0301編碼的蛋白屬于OmpA家族膜暴露蛋白,且在四種已測(cè)序致病株中是保守的，具

4、有較高的同源性。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)LA0301基因進(jìn)行了克隆，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，得到純化的重組蛋白。并用此純化的蛋白免疫新西蘭兔，得到了滴度較高的抗體。以此抗體進(jìn)行Western blot，研究了LA0301在15株中國(guó)流行鉤端螺旋體代表株中的保守性。利用Triton X-114技術(shù)分離抽提鉤端螺旋體膜蛋白，并利用此抗體研究LA0301在鉤端螺旋體中的膜定位,同時(shí)，以此抗體為一抗，運(yùn)用熒光顯微鏡技術(shù)研究LA0301在鉤端螺旋