新型促血小板生成融合蛋白體內(nèi)分布與免疫原性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性或繼發(fā)性造血功能障礙、尤其是嚴(yán)重血小板減少癥發(fā)生多，危害重，治療難度大，如何促進(jìn)血小板數(shù)量和功能恢復(fù)是造血重建領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。血小板的生成可受血小板生成素(TPO，thrombopoietin)、白介素-3(Interleukin-3，IL-3)、白介素-11(Interleuldn-11，IL-11)等多種造血因子調(diào)控,并認(rèn)為TPO受體途徑是重要的巨核細(xì)胞增殖信號(hào)通路。國(guó)內(nèi)外研究資料表明，應(yīng)用TPO基因工程產(chǎn)品有顯著升

2、血小板作用，但也存在有毒副反應(yīng)強(qiáng)和易產(chǎn)生中和性抗體之弊。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)了一種與TPO完全不同源、僅有14個(gè)氨基酸組成的TPO模擬肽，該短肽能與巨核細(xì)胞的TPO受體特異結(jié)合并激活增殖信號(hào)，發(fā)揮升血小板生物效應(yīng)，但由于該短肽分子量太小，因此它在體內(nèi)的生物半衰期很短，從而限制了其應(yīng)用。 人生長(zhǎng)激素是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。最近包括我們實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的一些國(guó)內(nèi)外研究小組發(fā)現(xiàn)，人生長(zhǎng)激素也能夠刺激巨核細(xì)胞增殖與分化，具有顯著的升血

3、小板作用。但由于其生理功能比較廣泛，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生一些其它的副作用。為此，如果能夠使其靶向性地作用于巨核細(xì)胞，不僅能夠進(jìn)一步提高其促血小板生成功效，而且還可以減少用量，降低副反應(yīng)。 為此，本單位研究人員創(chuàng)新性地將TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素進(jìn)行融合，使兩者在促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖與血小板生成方面取長(zhǎng)補(bǔ)短，形成一種新型靶向性高效升血小板重組融合蛋白。目前，本實(shí)驗(yàn)室已完成該重組融合蛋白的實(shí)驗(yàn)室小試生產(chǎn)制備，所得產(chǎn)品純度達(dá)98％以上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初

4、步表明該新型融合蛋白具有很好的升血小板活性，其升血小板效果可與重組人IL-11相媲美。 本課題正是在已有的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，重點(diǎn)分析了該新型融合蛋白在體內(nèi)的分布與代謝，對(duì)骨髓巨核細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，以及應(yīng)用該融合蛋白后機(jī)體的免疫反應(yīng)情況，旨在進(jìn)一步了解該融合蛋白的生物學(xué)特性和作用機(jī)理，并為其進(jìn)一步研發(fā)和將來(lái)的推廣應(yīng)用提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 實(shí)驗(yàn)中我們用125I標(biāo)記新型融合蛋白，尾靜脈注入正常小鼠體內(nèi)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)血液、骨髓等18

5、種組織中的放射性比活性，以此闡明融合蛋白在體內(nèi)的分布及代謝特性；以重組人IL-11和人生長(zhǎng)激素作為對(duì)照，對(duì)比分析該新型融合蛋白對(duì)放創(chuàng)復(fù)合傷大鼠骨髓巨核細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用；將該融合蛋白與佐劑充分乳化，按常規(guī)方法免疫注射，以及不加佐劑連續(xù)注射融合蛋白15天(類似治療方案)，采用ELISA和瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)血清中是否出現(xiàn)相應(yīng)抗體，初步了解新型融合蛋白分子的免疫原性。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)注射125I標(biāo)記的新

6、型融蛋白后放射性比活度檢測(cè)結(jié)果顯示，6小時(shí)以內(nèi)該融合蛋白主要分布在血液和骨髓組織中，之后骨髓組織的放射性比活度則顯著高于其他組織。提示該新型融合蛋白具有明顯的骨髓組織偏向分布特性。 2.應(yīng)用該新型融合蛋白能夠顯著提升放創(chuàng)復(fù)合傷大鼠骨髓組織中巨核細(xì)胞的數(shù)量，其效果可以與重組人IL-11相媲美；新型融合蛋白體內(nèi)注射后第7天和14天時(shí)，大鼠巨核細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)后巨核細(xì)胞集落數(shù)較對(duì)照組明顯增多。提示該新型融合蛋白具有顯著促巨核細(xì)胞增殖、分