果實(shí)成熟和品質(zhì)相關(guān)基因LeETR3-Lcyb共敲除載體構(gòu)建及MDHAR的初步解析.pdf

1、番茄因其富含番茄紅素等一系列重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種備受歡迎的世界性經(jīng)濟(jì)作物。但其成熟后極易腐爛變質(zhì)，不耐運(yùn)輸和儲(chǔ)藏，由此造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此如何延長(zhǎng)果實(shí)貨架期及保證其關(guān)鍵品質(zhì)一直是食品領(lǐng)域中重要的研究方向。目前，乙烯(C2H4)被認(rèn)為是促進(jìn)番茄成熟的重要植物激素，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其受體(LeETR3)與果實(shí)成熟密切相關(guān)。另一方面，番茄紅素β-環(huán)化酶(Lcyb)是代謝番茄紅素形成具環(huán)類(lèi)胡蘿卜素的關(guān)鍵酶，對(duì)于番茄紅素水平調(diào)控至關(guān)重要。

2、r>　　因此本文第一部分試圖運(yùn)用生物學(xué)方法CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)突變LeETR3與Lcyb以期達(dá)到延遲果實(shí)成熟并保證其番茄紅素含量的目的。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含潮霉素(Hyg)抗性的CRISPR/Cas9Pubi∷AtU∷LeETR3/Lcyb共敲除載體，但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)番茄AC對(duì)Hyg極其敏感，且Hyg篩選AC陽(yáng)性愈傷組織的最適濃度范圍在5 mg/L以下，不易篩選。因此本文又構(gòu)建了含卡那(Kana)抗性的CRISPR/Cas9P

3、35s∷AtU∷LeETR3/Lcyb，CRISPR/Cas9∷AtU∷LeETR3多靶點(diǎn)敲除載體，并將其成功轉(zhuǎn)入番茄中，以此得到了轉(zhuǎn)基因株系。本研究將CRISPR/Cas9多基因多靶點(diǎn)敲除技術(shù)成功應(yīng)用到番茄中，同時(shí)也為進(jìn)一步研究LeETR3和Lcyb在番茄保藏及品質(zhì)中的作用打下基礎(chǔ)。
　　眾所周知，獼猴桃是大眾非常喜愛(ài)的水果，其富含抗壞血酸(AsA)等抗氧化物質(zhì)。AsA對(duì)維持人類(lèi)正常生長(zhǎng)和健康具有重要意義。單脫氫抗壞血酸還原酶(

4、MDHAR)可以將單脫氫抗壞血酸(MDHA)還原成AsA。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在獼猴桃中有7個(gè)基因編碼MDHAR，但目前對(duì)獼猴桃中MDHAR的功能尚不明確。因此本文第二部分欲利用過(guò)表達(dá)獼猴桃MDHAR的轉(zhuǎn)基因株系初步探究其功能。本實(shí)驗(yàn)對(duì)純合的OE MDHAR1，OE MDHAR2和OE MDHAR6轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):MDHAR1和MDHAR2在轉(zhuǎn)錄水平均能表達(dá)且具有MDHAR酶活功能，并促進(jìn)了總AsA的合成。尤其是OE MDHAR2-1