氯喹干預(yù)戊四氮致癇作用的研究.pdf

1、癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病之一，對(duì)該病如何有效地防治是當(dāng)今神經(jīng)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。由于癲癇發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)其防治的研究未取得突破性進(jìn)展。我們以前的研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)告均證實(shí)，在癲癇發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，存在神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等因素的異常和相互調(diào)節(jié)的紊亂，由此首次提出了“神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)失衡與癲癇發(fā)生有關(guān)”的學(xué)說(shuō)，并認(rèn)為以神經(jīng)因素為主，免疫和內(nèi)分泌因素在受體、信使和基因表達(dá)水平發(fā)揮調(diào)控作用，為癲癇的綜合防治

2、開(kāi)拓了一條新的路徑。因此，有效調(diào)控神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的平衡，對(duì)癲癇發(fā)生和復(fù)發(fā)的防治具有重要意義。 氯喹為一種傳統(tǒng)的抗瘧疾藥。新近的研究證實(shí)其藥理作用非常廣泛，如通過(guò)與DNA結(jié)合抑制細(xì)胞的分裂增殖、抑制人單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞因子的合成與分泌、抑制蛋白質(zhì)的合成及一些酶的活性、與CaM結(jié)合后影響鈣調(diào)蛋白及其效應(yīng)酶活性等。另由于其影響進(jìn)入DNA復(fù)制途徑和基因表達(dá)途徑中的一些酶的活性，從而影響DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄。基于上述藥理作用

3、，氯喹已被用于幾種與免疫及增生有關(guān)疾病的防治(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)，并取得了令人滿意的結(jié)果，有些尚在臨床評(píng)估過(guò)程中(如AIDS)。 本論文共分6個(gè)部分，第1～5部分的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)、PTZ致癇組(18只)和氯喹干預(yù)組(18只)。PTZ致癇組經(jīng)腹腔注射PTZ(60mg/kg)致癇，氯喹干預(yù)組預(yù)先在側(cè)腦室注射氯喹6μl(0.61mg/kg)，2h后

4、腹腔注射PTZ致癇，對(duì)照組側(cè)腦室注射生理鹽水6μl。然后觀察記錄3組大鼠的行為表現(xiàn)，參照Smialowski的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)分為6級(jí)，并在注射后2h內(nèi)分別記錄大腦皮質(zhì)和海馬的腦電變化。4％的多聚甲醛灌注，恒冷箱(-20℃)切片機(jī)作額狀切片，用免疫組化做膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnucleusantigen,PCNA)、Glu、NR

5、1、IL-1β、TNF-α、ER、PR和CaMKⅡ標(biāo)記；Westernblotting檢測(cè)皮質(zhì)和海馬CyclinD1、NR1、TNF-α、ER和CaMKⅡ的含量。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)作半定量分析。 結(jié)果顯示：(1)行為表現(xiàn)：對(duì)照組無(wú)癇樣發(fā)作，PTZ致癇組癇樣發(fā)作重(Ⅳ～Ⅴ)，氯喹干預(yù)組發(fā)作輕(多在Ⅰ～Ⅲ級(jí))(P＜0.01)；(2)腦電記錄：對(duì)照組無(wú)癇樣放電，PTZ致癇組呈典型的癇樣波，氯喹干預(yù)組表現(xiàn)為慢波和小棘波；(3)GFAP、

6、PCNA和CyclinD1在PTZ致癇組的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)，氯喹干預(yù)組無(wú)明顯增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)；(4)Glu和NR1在PTZ致癇組表達(dá)明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，氯喹干預(yù)組無(wú)明顯增強(qiáng)；(5)IL-1β和TNF-α在PTZ致癇組腦內(nèi)表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，氯喹干預(yù)組無(wú)明顯變化(P＞0.05)；(6)ER在PTZ致癇組腦內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)，PR表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組比較差異有

7、顯著性(P＜0.05)，兩者在氯喹干預(yù)組與對(duì)照組的比較無(wú)明顯變化(P＜0.05)；(7)CaMKⅡ在PTZ致癇組、氯喹干預(yù)組和對(duì)照組腦內(nèi)的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。 根據(jù)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，初步得出如下結(jié)論：(1)氯喹抑制PTZ致癇大鼠的癇樣發(fā)作和癇樣放電；(2)氯喹對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性有抑制作用；(3)氯喹通過(guò)不同途徑、多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)Glu、NR1信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活進(jìn)行干預(yù)，從而影響癲癇的發(fā)生和發(fā)展；(4)氯喹抑制腦內(nèi)IL

8、-1β和TNF-α的合成與分泌；(5)氯喹通過(guò)對(duì)雌激素合成過(guò)程中P450芳香化酶活性的抑制而減少雌激素的合成，增加孕激素的產(chǎn)生，從而降低雌激素-ER信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，增強(qiáng)孕激素-PR信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，抑制由性激素介導(dǎo)的癇樣發(fā)作。(6)氯喹通過(guò)對(duì)CaMKⅡ活性的干預(yù)發(fā)揮抑癇作用。 氯喹抑癇的機(jī)制可能是通過(guò)：(1)氯喹與DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合，干擾了DNA的復(fù)制；(2)其能升高溶酶體和高爾基器網(wǎng)泡內(nèi)的pH值，抑制一些酶的活性，包括酸

9、性水解酶、蛋白質(zhì)修飾酶等，從而影響翻譯后新合成蛋白質(zhì)的修飾；(3)氯喹通過(guò)升高核內(nèi)體內(nèi)的pH值，干擾Fe2+從轉(zhuǎn)鐵蛋白的解離，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度降低，影響進(jìn)入DNA復(fù)制途徑和基因表達(dá)途徑中幾種酶的活性，從而影響DNA的復(fù)制和基因的表達(dá)；(4)氯喹與CaM之間通過(guò)縮水作用和靜電作用而結(jié)合，影響鈣調(diào)蛋白及其效應(yīng)酶的活性，細(xì)胞Ca2+內(nèi)流減少，降低組織的興奮性，抑制癇樣發(fā)作和癇樣放電；(5)氯喹通過(guò)抑制IL-1β和TNF-α的合成與分泌，降低

10、了免疫因素在癲癇發(fā)病中的作用而發(fā)揮抑癇作用；(6)氯喹通過(guò)抑制雌激素代謝過(guò)程中P450芳香化酶的活性，影響由雌、孕激素介導(dǎo)的腦的興奮性。 綜上所述，我們認(rèn)為氯喹可能通過(guò)對(duì)神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等因素的調(diào)控，發(fā)揮其抑癇作用，這些作用可能在綜合防治癲癇的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)及癲癇發(fā)病機(jī)制的闡明方面具有重要的理論和臨床實(shí)用價(jià)值。 第6部分：研究星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，Ast)與神經(jīng)元之問(wèn)信號(hào)交流的分子機(jī)制。用馬桑內(nèi)酯(cori

11、arialactone，CL)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(astrocytecontinedmedium，ACM)對(duì)大鼠腦內(nèi)Glu及其GluR2表達(dá)的影響作了觀察。把培養(yǎng)的AstACM分為對(duì)照組(不加任何刺激因素)和CL激活組(2.5×10-5mol/L)，激活2h后收集培養(yǎng)液，然后用于在體側(cè)腦室注射實(shí)驗(yàn)。40只成年健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(8只，注射未加刺激物的ACM10μl)和CL組(注射CL激活的ACM10μl)，按注射

12、后的時(shí)間分為2h、4h、8h和12h(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只)。然后觀察兩組大鼠的行為表現(xiàn)，用免疫組化和免疫熒光檢測(cè)腦內(nèi)Glu和GluR2表達(dá)的變化，Westernblotting檢測(cè)腦內(nèi)GluR2含量的變化。結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射CL激活的ACM的大鼠有癇樣發(fā)作，而對(duì)照組無(wú)癇樣發(fā)作；免疫組化和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Glu在注射CL激活的ACM組的皮質(zhì)和海馬表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(P＜0.05)，而GluR2在皮質(zhì)和海馬表達(dá)較對(duì)照組減弱(P＜0.05)