攜帶Survivin特異性siRNA的完全人源性肝癌單鏈抗體-魚精蛋白截短體融合蛋白對(duì)肝癌凋亡的影響研究.pdf

1、對(duì)于多數(shù)不能手術(shù)的肝癌患者目前仍無有效治療手段。近年來以RNA干擾技術(shù)為代表的新型腫瘤靶向治療方法日益受到關(guān)注。單鏈抗體（ScFv）作為一種新型的腫瘤靶向治療載體顯示了良好的應(yīng)用前景。我們從自行建立的全人源性肝癌ScFv抗體庫(kù)中篩選到了1株肝癌ScFv，在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)后得到了可溶性的、具有生物學(xué)功能的ScFv蛋白，且通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的結(jié)合能力。魚精蛋白(protamine)[1-3]是一種富含陽(yáng)離子的強(qiáng)堿性蛋白，

2、結(jié)合DNA的能力強(qiáng)。有研究者應(yīng)用魚精蛋白截?cái)囿w與陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA按照一定比例混合，成功地提高了轉(zhuǎn)染效率。而Survivin[4,5]是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族（inhibition of apoptosis protein，IAP）家族中的一員，對(duì)凋亡有極強(qiáng)的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)Survivin在肝癌組織中高表達(dá)。本研究旨在該肝癌特異性單鏈抗體ScFv和魚精蛋白截短體（tP）重組的方法，構(gòu)建以ScFv區(qū)作為靶向腫瘤部位的功能區(qū)、以t

3、P作為效應(yīng)功能區(qū)的ScFv/tP融合蛋白，并對(duì)該融合蛋白的功能進(jìn)行鑒定以及研究；同時(shí)將ScFv/tP融合蛋白與細(xì)胞凋亡抑制基因Survivin特異性siRNA體外孵育形成復(fù)合物，檢測(cè)該復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，為研究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定理論基礎(chǔ)，為開發(fā)依賴抗體介導(dǎo)的肝癌靶向藥物建立研究平臺(tái)。
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　目的:ScFv/tP融合基因的構(gòu)建及表達(dá)
　　方法:設(shè)計(jì)攜帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的ScFv引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增；用

4、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ與EcoRⅠ酶切pET28/ScFv，核酸電泳后回收ScFv；人工合成兩條tP編碼寡核苷酸序列，在其兩端帶上可以直接與經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ酶切的載體相連接的HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的粘端序列。將兩條tP緩慢退火后，與從質(zhì)粒、用EcoRⅠ和XhoⅠ切下的ScFv一起連入經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的原核表達(dá)載體pET32a中；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)

5、序；將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒在大腸桿菌E.coliBL21trxB中誘導(dǎo)表達(dá)，利用HisTrapNi-NTA螯合層析介質(zhì)純化所得蛋白，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定。
　　結(jié)果及結(jié)論:經(jīng)酶切鑒定以及測(cè)序證實(shí)：擴(kuò)增的目的基因序列正確，成功構(gòu)建了含有ScFv/tP的原核表達(dá)載體。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，所獲得的ScFv/tP融合蛋白大小與預(yù)測(cè)大小一致，約42kDa。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　目的:ScFv/tP融合蛋白的活性功能研究

6、r>　　方法:選用人肝癌細(xì)胞HepG2，人正常肝細(xì)胞7701等檢測(cè)ScFv/tP融合蛋白靶向性；間接免疫熒光檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2，人正常肝細(xì)胞7701對(duì)ScFv/tP融合蛋白內(nèi)吞效果；凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ScFv/tP融合蛋白與DNA結(jié)合活性；光學(xué)以及熒光倒置顯微鏡觀察ScFv/tP融合蛋白對(duì)siRNA的靶向傳遞情況。
　　結(jié)果:間接免疫熒光檢測(cè)提示ScFv/tP融合蛋白可內(nèi)化進(jìn)入人肝癌細(xì)胞HepG2，但不能內(nèi)化進(jìn)入人正常肝細(xì)

7、胞7701；凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)提示ScFv/tP融合蛋白具有DNA結(jié)合活性；光學(xué)以及熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ScFv/tP融合蛋白能夠?qū)iRNA靶向傳遞入人肝癌細(xì)胞HepG2，但不能傳遞入人正常肝細(xì)胞7701。
　　結(jié)論：ScFv/tP融合蛋白能夠被人肝癌細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而不能被人正常肝細(xì)胞所內(nèi)化；ScFv/tP融合蛋白既具有肝癌特異的靶向性，又具有DNA結(jié)合活性；ScFv/tP融合蛋白能夠?qū)iRNA特異性的傳遞入人肝癌細(xì)胞，

8、而不能傳遞入人正常肝細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　目的:攜帶Survivin特異性siRNA的ScFv/tP融合蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響
　　方法：流式細(xì)胞儀定量分析siRNA與ScFv/tP融合蛋白最佳的轉(zhuǎn)染比例；利用RT-PCR、REAL-PCR和Western-Blot分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)利用ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)Survivin的抑制情況；流式細(xì)胞儀定量分析ScFv/

9、tP融合蛋白轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA的效率；流式細(xì)胞儀定量分析ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA后對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響；掃描及透射電鏡定性分析ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞儀和TUNEL染色法定量分析ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA后對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響；MTT以及臺(tái)盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)定量分析ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響；PCR

10、Array定量分析ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，測(cè)量不同處理組種植瘤的大小，在體內(nèi)條件下，采用間接免疫熒光檢測(cè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裸鼠體內(nèi)肝癌種植瘤細(xì)胞對(duì)ScFv/tP融合蛋白的內(nèi)吞效果，采用HE染色法、TUNEL染色法檢測(cè)ScFv/tP融合蛋白轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA后對(duì)肝癌種植瘤細(xì)胞凋亡的影響，采用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)不同處理組對(duì)種植瘤肝癌細(xì)胞內(nèi)Sur