同種異基因骨髓移植后α-GalCer的應(yīng)用加速免疫重建并未加重aGVHD.pdf

1、目的：造血干細(xì)胞移植后免疫重建及急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-host disease，aGVHD)的研究為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。NKT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一新型的調(diào)節(jié)型細(xì)胞，α-GalCer(α-galactosylceramide，α-半乳糖神經(jīng)酰胺)，能特異性識(shí)別并激活NKT細(xì)胞，迅速的大量的分泌IFN-γ及IL-4。本研究在小鼠同種異基因骨髓移植模型中探討移植后受鼠體內(nèi)α-GalCer的應(yīng)用是否有促進(jìn)免疫重

2、建的作用，同時(shí)不加重aGVHD，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　 方法：1.建立同種異基因清髓性骨髓移植模型。C57BL/6小鼠為供鼠，BALB/c小鼠為受鼠。首先摸索出最小的清髓性輻射劑量，之后以此輻射劑量作為骨髓移植前的預(yù)處理，建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的骨髓移植模型。2.利用aGVHD相對(duì)較輕的骨髓移植模型，實(shí)驗(yàn)組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，對(duì)照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。移植后同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)兩組

3、小鼠脾臟的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+、CD86+、CD11c+、CD80+細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目；供者細(xì)胞嵌合率；胸腺的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞組份；造血重建。并進(jìn)行體外造血干細(xì)胞集落的培養(yǎng)及體內(nèi)、外T、B細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)。3.利用aGVHD嚴(yán)重程度不同的兩個(gè)骨髓移植模型，實(shí)驗(yàn)組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，對(duì)照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。在每個(gè)移植模型中觀察兩組小鼠的生存期、aGVHD的

4、臨床表現(xiàn)和病理改變、供者細(xì)胞嵌合率。并進(jìn)行移植后6小時(shí)血清及移植后d27脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的檢測(cè)；體內(nèi)、外胸腺、脾臟、外周血、外周淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞及T細(xì)胞的遷移檢測(cè)。
　　 結(jié)果：1.≥7.5Gy TBI為清髓劑量。以7.5Gy TBI為預(yù)處理，在輸注相同的骨髓細(xì)胞數(shù)的前提下，輸注脾細(xì)胞數(shù)3×107及1×107，建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的同種異基因骨髓移植模型。2.在輸注脾細(xì)胞數(shù)1×107骨髓移植模型中，骨髓移

5、植后d70，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+及CD86+細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組，CD11c+、CD80+細(xì)胞的比例兩組間無區(qū)別；胸腺單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的比例兩組間無區(qū)別，且均較正常小鼠明顯偏低。移植后早期d7，實(shí)驗(yàn)組供者細(xì)胞嵌合率高于對(duì)照組。移植后d3，實(shí)驗(yàn)組外周血白細(xì)胞高于對(duì)照組。體外造血干細(xì)胞集落培養(yǎng)，α-GalCer組較DMSO組CFU數(shù)目明顯多。

6、體內(nèi)、外T、B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，α—GalCer組較DMSO組T、B細(xì)胞明顯增殖。3.在aGVHD嚴(yán)重程度不同的兩個(gè)骨髓移植模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠較對(duì)照組小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，aGVHD臨床表現(xiàn)及病理改變減輕。4.在輸注脾細(xì)胞數(shù)1×107移植模型中，移植后6小時(shí)血清中IL-4水平實(shí)驗(yàn)組小鼠與腹腔注射α-GalCer的正常小鼠、腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無差異，均明顯高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠；血清中IFN-γ水平實(shí)驗(yàn)組小鼠與

7、腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無差異，稍高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠，均明顯低于腹腔注射α-GalCer的正常小鼠。移植后d27脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-10水平實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，而IFN-γ、IL-2水平實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組。5.體內(nèi)、外遷移實(shí)驗(yàn)：在α-GalCer的作用下單個(gè)核細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞從胸腺、脾臟、外周血中出來，遷移至外周淋巴結(jié)。
　　 結(jié)論：1.BALB/c小鼠接受60

8、Coγ射線TBI的致死劑量是≥7.5Gy。在接受7.5Gy TBI的預(yù)處理后，輸注相同的骨髓細(xì)胞數(shù)的前提下，輸注不同的脾細(xì)胞數(shù)建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的骨髓移植模型，隨著輸注脾細(xì)胞數(shù)增加，aGVHD的嚴(yán)重程度隨之增加。2.移植后α-GalCer的應(yīng)用促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的免疫重建，同時(shí)增加第二刺激信號(hào)CD86、CD40的表達(dá)。3.α-GalCer加速的免疫重建與α-GalCer促進(jìn)供者細(xì)胞的早期植入、促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)