FOXO1及牙周病致病菌影響口腔黏膜愈合機制.pdf

1、口腔黏膜由復層鱗狀上皮細胞覆蓋，該層細胞形成了抵御病原微生物入侵的重要防線。受黏膜上皮細胞遷移及增殖活性影響，黏膜上皮的再上皮化進程很大程度上決定了黏膜傷口的愈合速度。以往研究顯示，糖尿病導致的高糖環(huán)境嚴重降低了皮膚上皮角化細胞的遷移和增殖能力，進而減緩了皮膚傷口的愈合速度。而作為叉頭轉錄因子亞家族成員的FOXO1轉錄因子被證實能夠參與細胞凋亡、抗氧化應激和糖代謝的調節(jié)，相比于血糖正常動物的皮膚傷口區(qū)域，糖尿病動物皮膚傷口區(qū)域FOXO1

2、活性顯著提高。然而，目前有關糖尿病影響口腔黏膜傷口愈合的相關研究極少。本文分析了血糖正常及糖尿病情況下的口腔黏膜傷口愈合過程，并研究了FOXO1對口腔黏膜傷口愈合的影響，此外，還考察了口腔內牙周病致病菌作為潛在的局部影響因素，對口腔黏膜傷口愈合的影響。
　　(1) FOXO1影響口腔黏膜傷口愈合細胞機制:本文首先利用Cre/loxP系統(tǒng)敲除了小鼠上皮細胞中的FOXO1基因，并通過鏈尿霉素腹腔注射以使小鼠形成I型糖尿病。隨后，通過穿

3、孔器使小鼠舌背表面形成1.5 mm直徑的黏膜傷口，以比較不同小鼠的傷口愈合情況。研究結果顯示，與血糖正常動物相比，糖尿病動物受高糖環(huán)境的影響，其黏膜上皮細胞的遷移和增殖活性分別下降了83％和54％，導致糖尿病動物黏膜傷口愈合速度顯著降低，體外實驗也證實了高糖環(huán)境對細胞遷移和增殖活性的抑制作用。為分析細胞遷移和增殖活性的改變機制，本文考察了上皮細胞中特異性敲除FOXO1基因的小鼠，在血糖正常與糖尿病情況下的愈合情況。研究發(fā)現(xiàn)，受糖尿病的影

4、響，F(xiàn)OXO1在傷口區(qū)黏膜上皮細胞中的活化水平較血糖正常動物高2.6倍，而FOXO1基因敲除后，受糖尿病影響而降低的細胞遷移和增殖活性均顯著恢復，但是，在血糖正常動物中，基因敲除通過降低細胞遷移活性進而減緩了傷口愈合。
　　(2) FOXO1下游靶基因的篩選及鑒定:為考察FOXO1影響口腔黏膜傷口愈合的分子機制，通過基因芯片及Real-time PCR技術，篩選出受FOXO1調控及高糖環(huán)境影響的下游基因CCL20和IL1F9。結果

5、顯示，受高糖環(huán)境的刺激，體外培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細胞中CCL20和IL1F9的mRNA分別提高了64％和33％，而受FOXO1基因敲除的影響，CCL20和IL1F9的mRNA水平顯著降低。與體外實驗結果一致，在糖尿病動物的口腔黏膜傷口新生上皮中，CCL20和IL1F9蛋白表達水平較血糖正常動物顯著提高，而在FOXO1基因敲除后，二者蛋白表達水平顯著降低。
　　(3) CCL20與IL1F9對口腔黏膜上皮細胞遷移的影響:本文利用中和

6、抗體，降低了高糖環(huán)境中口腔黏膜上皮細胞產生的過量CCL20及IL1F9，以考察其對細胞遷移活性的直接影響。過量的CCL20或IL1F9被中和后，細胞在高糖環(huán)境中的遷移水平分別提高60％及110％。當CCL20與IL1F9被同時中和后，細胞遷移活性的提升表現(xiàn)出疊加的效果。同時，在標準低糖濃度環(huán)境中，添加重組的CCL20或IL1F9導致細胞的遷移活性降低。上述研究結果均表明，過量的CCL20與IL1F9抑制了細胞遷移，進而解釋了高糖環(huán)境通過

7、刺激FOXO1活化而提高其下游靶基因的轉錄，從而影響?zhàn)つど掀ぜ毎倪w移，并最終影響口腔黏膜傷口愈合的分子機制。
　　(4)牙周病致病菌對口腔黏膜傷口愈合的影響及IgY抑菌效果:通過考察口腔內牙周病主要致病菌——具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌，對口腔黏膜傷口愈合的影響發(fā)現(xiàn)，兩種病原菌通過刺激黏膜上皮細胞的凋亡，從而降低了黏膜上皮細胞的再上皮化速度。為探索抑制口腔內病原微生物安全有效的方法，將兩種病原菌免疫蛋雞并分離純化得到卵黃抗體(Ig

8、Y)，體外實驗表明，抗具核梭桿菌和抗牙齦卟啉單胞菌特異性IgY均能有效地抑制細菌生長，免疫熒光和免疫電鏡實驗觀察到IgY可與兩種病原菌高效結合，初步探討了IgY抑制牙周病致病菌生長的作用機制。體內實驗表明，IgY能夠抑制牙周病致病菌在口腔內定植引起的牙周病的發(fā)展。由于對牙周病致病菌的抑制，IgY可能會加速由致病菌減緩的口腔黏膜傷口愈合。
　　綜上所述，受糖尿病影響，口腔黏膜傷口愈合速度顯著降低。高糖環(huán)境刺激FOXO1轉錄因子的活化

9、，而提高其下游靶基因CCL20和IL1F9的表達，利用中和抗體降低口腔黏膜上皮細胞產生的過量CCL20和IL1F9，發(fā)現(xiàn)細胞的遷移水平顯著提高，闡明了高糖環(huán)境中過度活化的FOXO1抑制口腔黏膜傷口愈合機制。在正常糖濃度下，F(xiàn)OXO1的敲除通過降低細胞的遷移水平而減緩口腔黏膜傷口愈合速度，證實了FOXO1在正常糖濃度環(huán)境中對傷口愈合的必要性。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，口腔內的具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌，通過刺激口腔黏膜上皮細胞的凋亡，從而降低口腔