抗WSSV囊膜蛋白單抗的中和效果研究.pdf

1、本論文利用抗WSSV蛋白VP28、VP26、VP19的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)腹水并進(jìn)行了提純；利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和克氏原螯蝦(Cambarusproclarkii)檢測了單抗在不同病毒濃度下以及單抗兩兩混合的中和效果，結(jié)果表明MAb1D6(VP28)隨病毒濃度的降低，體內(nèi)中和效果越明顯；同時(shí)提取了VP28、VP26、VP19三種蛋白并通過雙向電泳對(duì)囊膜蛋白VP28進(jìn)行初步分析。具體研究結(jié)果如下： (1) WSSV

2、的提純及抗WSSV囊膜蛋白單克隆抗體的生產(chǎn)：使用差速離心和蔗糖密度梯度離心法提純WSSV。復(fù)蘇了本實(shí)驗(yàn)室制備的1D6、2G3、3G7、2E9等4株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，通過生產(chǎn)腹水得到了足量的抗體并對(duì)其進(jìn)行提純。經(jīng)間接免疫熒光檢測，四株抗體與感染W(wǎng)SSV的蝦鰓均呈特異性反應(yīng)。經(jīng)Western-Blot檢測，1D6、2G3能與WSSV蛋白VP28反應(yīng)，3G7能與WSSV蛋白VP26反應(yīng)，2E9能與WSSV蛋白VP19反應(yīng)。 (2)

3、不同病毒濃度下WSSV單抗的體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)：通過酶聯(lián)免疫吸附法測定不同稀釋度的WSSV與已制備的WSSV襄膜蛋白單克隆抗體1D6及2E9結(jié)合的OD值。結(jié)果顯示，在1×10-3病毒稀釋度下兩種單抗均足量。利用克氏原螯蝦動(dòng)物模型，將不同稀釋度病毒與單抗1:1混合孵育2h后，肌肉注射克氏原螯蝦(50μL/只)，觀察記錄螯蝦的死亡情況。結(jié)果顯示當(dāng)病毒濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6稀釋度時(shí)，MAb1D6(VP28)螯蝦

4、組最終死亡率分別為100％、90％、16.7％、6.7％，而MAb2E9(VP19)螯蝦組最終死亡率分別為100％、100％、100％、93.3％。這表明隨病毒濃度的降低，MAb1D6(VP28)的中和效果越明顯。而MAb2E9(VP19)并無明顯的中和效果。在螯蝦中和實(shí)驗(yàn)中，除陰性對(duì)照組、MAb1D6(VP28)的1×10-5、1×10-6病毒稀釋度組之外，死亡螯蝦經(jīng)間接免疫熒光檢測均呈WSSV感染陽性。 (3) WSSV混合

5、單抗的中和實(shí)驗(yàn)：提取中國對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細(xì)胞膜并對(duì)WSSV進(jìn)行地高辛標(biāo)記，將單抗兩兩混合后與病毒作用，吸附對(duì)蝦血細(xì)胞膜，使用抗地高辛抗體檢測結(jié)合到血細(xì)胞膜上的病毒。結(jié)果顯示混合前后OD值無明顯變化，因此不能證明四株單抗之間具有協(xié)同作用。利用克氏原螯蝦動(dòng)物模型，將MAb1D6(VP28)與另外三株抗體分別混合，將混合液與WSSV粗提液1:1混合孵育2h后，肌肉注射克氏原螯蝦(50μL/只)，觀察記

6、錄螯蝦的死亡情況。結(jié)果顯示單抗混合之后螯蝦的累積死亡率與MAb1D6(VP28)螯蝦組的累積死亡率無顯著差異，因此不能證明MAblD6(VP28)與其他三株抗體之間具有協(xié)同作用。 (4) WSSV囊膜蛋白VP28的初步分析：通過對(duì)病毒進(jìn)行SDS-PAGE，切膠分離病毒蛋白，并洗脫提純，獲得了VP28，VP26及VP19三種蛋白。經(jīng)Western-blot檢測，所提取的VP28蛋白與MAb1D6以及MAb2G3均呈陽性反應(yīng)。將VP