E1A-E1B雙重修飾的7型溶癌腺病毒的構(gòu)建研究.pdf

1、溶癌腺病毒載體(Oncolytic adenovectors)，又稱條件復(fù)制型腺病毒載體(Conditionally replicating adenoviruses，CRADs)，其中條件復(fù)制的含義是指這種腺病毒載體能夠在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制，通過病毒擴(kuò)增，裂解、殺傷腫瘤細(xì)胞，而在正常細(xì)胞中不能擴(kuò)增或擴(kuò)增率極低[1]。正是由于CRADs能夠在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、傳播的特性，從而較好地克服了復(fù)制缺陷型病毒載體在基因治療中的基因轉(zhuǎn)移效率低，難

2、以殺滅大多數(shù)腫瘤細(xì)胞這一缺點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于腫瘤基因治療研究中。通常CRADs攜帶治療基因后，較不含治療基因的CRADs能夠更有效的殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　為解決重組復(fù)制缺陷型腺病毒治療惡性腫瘤存在的靶向性差、目的基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短等缺點(diǎn)，本研究采用CRADs構(gòu)建的傳統(tǒng)方法:利用穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在細(xì)胞中同源重組來獲得重組病毒，最后通過空斑純化，排除污染、獲得均一的目的病毒。具體策略為:利用分子生物學(xué)手段對野生7型腺病腺病毒(Adeno

3、virus，Ad)毒進(jìn)行雙重修飾:一方面利用腫瘤特異性的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)啟動(dòng)子來調(diào)控制溶癌過程所必需的E1A和E1B-55kDa基因的表達(dá);另一方面將干擾溶癌過程且病毒復(fù)制非必需的E1B-19kDa基因進(jìn)行缺失，使得到的重組病毒既能保持腫瘤增殖特異性，又具有較高的溶癌效率。
　　首先構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-IRES-HEAB。具體為將從人基

4、因組DNA擴(kuò)增的hTERT啟動(dòng)子，克隆替換前期構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-HEAB(攜帶腺病毒E1A和E1B-55kDa區(qū))的PCMV IE啟動(dòng)子，具體構(gòu)建程序?yàn)?參照Genbank的Ad7基因組全序列(BK005235)，PCR擴(kuò)增E1A的完整ORF片段，克隆至pIRESneo(clontech)的多克隆位點(diǎn);擴(kuò)增E1B-55kDa，克隆至pIRESneo的SmaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)，替換Neor片段;最后PCR擴(kuò)增Ad7左側(cè)1-470片段并克

5、隆至pIRES-HEAB質(zhì)粒的hTERT基因上游，獲得最終的病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-IRES-HEAB。
　　野生Ad7病毒株經(jīng)分離、培養(yǎng)及鑒定后，大量擴(kuò)增病毒，提取其基因組DNA，利用NhelⅠ酶切獲得野生Ad7病毒基因組NhelⅠ大片段(795-14220)，酶切野生Ad7病毒基因組得到NotⅠ片段(13171-ITR)，將其回收后做為Ad7病毒基因組骨架序列。根據(jù)基因序列的互補(bǔ)重疊部分，將上述酶切片段與病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-I

6、RES-HEAB通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)基因重組，重組出新型溶癌腺病毒 Ad7OL，空斑純化后，提取重組腺病毒的DNA進(jìn)行PCR、酶切分析，確定為重組正確的腺病毒株后，進(jìn)一步用CsCl密度梯度離心純化，并用終點(diǎn)稀釋法(end pointdilution assay, EPDA)測定病毒的滴度。
　　為了初步研究重組溶癌腺病毒Ad7OL的體外抑殺瘤作用，選用3種端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞系和1種端粒酶陰性細(xì)胞系:A549

7、(人肺癌細(xì)胞株)、Hela(人宮頸癌細(xì)胞株)和293(人胚腎細(xì)胞系);LO2（人胎肝細(xì)胞系），從而評價(jià)載體的選擇性腫瘤殺傷效應(yīng)。將Ad7OL或野生Ad7感染正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，感染后7d，結(jié)晶紫染色法檢測病毒細(xì)胞毒性。
　　總之，本研究在野生7型腺病毒基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建的E1A/E1B雙重修飾的溶癌病毒，基本上能滿足理想腫瘤增殖病毒主要要求，是研制溶癌病毒過程中的一個(gè)有益嘗試，也希望本課題所設(shè)計(jì)的7型溶癌腺病毒能為利用不同血清型來源