分離純化的脂肪干細胞(CD34+CD31-)成軟骨分化能力的初步研究.pdf

1、種子細胞來源是限制軟骨組織工程應用于臨床的關鍵問題。脂肪間充質干細胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)來源豐富，取材容易，體外倍增速度快，免疫原性低，有望成為組織工程與再生醫(yī)學的理想種子細胞來源。然而脂肪組織經酶消化后，得到的是基質血管部分（Stromal vascular fraction，SVF），其中具有多向分化潛能的干細胞所占的比例較小，成軟骨能力較弱，需要對其進行分離純化，提高ASCs的比例。新

2、鮮分離的干細胞中高表達CD34，通過流式分選技術，采用CD34和CD31這兩個標志物對SVF進行流式細胞分選(CD34+CD31-)，并將分離純化的ASCs用于組織工程化軟骨的構建，為優(yōu)化軟骨組織工程種子細胞提供理論依據(jù)。
　　目的：從脂肪組織中分離純化CD34+CD31-細胞亞群，比較CD34+CD31-細胞亞群與未分選細胞的表面標志，證實流式細胞分選CD34+CD31-細胞是分離純化ASCs的有效方法，并對CD34+CD31-

3、細胞亞群與SVF進行成軟骨相關檢測，驗證CD34+CD31-細胞亞群的成軟骨潛能。
　　1、脂肪干細胞的分離純化與表面標志鑒定
　　方法:將脂肪抽吸術得到的脂肪組織經膠原酶消化得到新鮮分離的SVF，對其進行流式細胞分選，分選出CD34+CD31-的細胞亞群，即人脂肪干細胞(Humanadipose-derived stem cells，hASCs)，對hASCs(CD34+CD31-)和未分選細胞(SVF)的進行干細胞表面標

4、志物的流式分析。
　　結果:新鮮分離的SVF中CD34表達率約為88.37％。采用CD34和CD31(CD34+CD31-)對新鮮分離的SVF進行分選，CD34+CD31-亞群約占66.74％且隨年齡增大，比例有所升高。CD34+CD31-亞群表面CD44、CD90、CD73均呈陽性表達，且明顯高于SVF，CD45、CD105均為陰性表達。
　　2、二維培養(yǎng)條件下驗證hASCs(CD34+CD31)的成軟骨潛能
　　方

5、法:將分選出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分別在二維（單層培養(yǎng)）條件下進行成軟骨誘導，通過Real-time PCR檢測成軟骨相關基因Aggrecan和Ⅱ型膠原及軟骨肥大基因X型膠原的表達，甲苯胺藍和免疫組化染色對軟骨基質及Ⅱ型膠原進行半定量檢測，比較hASCs(CD34+CD31-)和未分選細胞的成軟骨潛能。
　　結果:hASCs(CD34+CD31-)和SVF在成軟骨誘導14天后，Aggrecan、Ⅱ型膠原及X型

6、膠原表達量均上調，兩者相對表達量無差異，甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原染色均為陽性，二者積分光密度無統(tǒng)計學差異。
　　3、三維培養(yǎng)條件下驗證hASCs(CD34+CD31-)的成軟骨潛能
　　方法:將分選出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分別在三維(pellet)條件下進行成軟骨誘導，進行大體觀察、HE、甲苯胺藍、番紅O及免疫組化染色，并檢測GAG含量，比較hASCs(CD34+CD31-)和未分選細胞的成軟骨潛能。

7、r>　　結果:hASCs(CD34+CD31-)組在三維條件下成軟骨誘導28天后，形成的pellet較SVF組更接近軟骨組織形態(tài)，甲苯胺藍、番紅O及Ⅱ型膠原染色均為陽性，積分光密度均高于SVF組，GAG含量兩組無統(tǒng)計學差異。
　　結論：1、新鮮分離的SVF中高表達CD34，年齡因素不影響SVF中CD34的表達。與SVF相比，采用流式分選得到的CD34+CD31-亞群高表達干細胞表面標志物，因而認為通過流式分選可成功分離純化hASC