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文檔簡介
1、目的;腫瘤特異性啟動子Survivin調控shRNA真核表達載體腺病毒的構建以及對HepG-2細胞中CD133基因表達的抑制作用。
方法;1、pEntry-SUR-GFP-shRNA真核表達載體的構建;參考試劑盒說明書提取HepG-2細胞基因組DNA。根據GenBank(-222 to+39,GeneBank Accession NumberAY795969)提供的survivin啟動子基因序列及pEntry載體上的酶切位點設
2、sal1和NdeⅠ酶切位點(上下游引物序列)5-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC-3,下游引物序列5-GGAATTCCATATGGAATTCC-3擴增片段為270BP將survivin啟動子克隆到pEntry-EF1-GFP-shRNA上,以替換EF1啟動子,構建pEntry-Surp-GFP-shRNA真核表達載體。
2、pEntry-Surp-GFP-shRNA轉染Hela.HepG-2293T細胞
3、株;RT-PCR檢測GFP證實GFP的表達由survivin驅動,反應引物上序列為5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3,下游引物序列為5-TTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTG-3,長度200 bp,通過轉染細胞的熒光強弱,證實survivin在HepG-2。Hela細胞株中有熒光,而293T細胞株中沒有熒光,且HepG-2細胞株表達高于Hela細胞,說明survivin基因具有腫瘤特異性。
3、shRN
4、A CD133的設計,合成以及Ad.surp-GFP-shRNA的構建和包裝:根據GenBank中CD133的核苷酸序列,參考Ambion公司設計shRNA的設原則,(1)設計3條干擾序GCTCAGAACTTCATCACAAAC2377),AAGCCAGAAACTGTAATCTTAG(485), ATGAGATTAAGTCCATGGCAAC(972),(2)通過Blast檢索確定三個干擾片段與人類的其他基因不同源;shRNA的合成;將三
5、個干擾片段切成六個小的片段,送華大基因公司合成12條Oligo片段。紫外線分光光度計在260 nm波長下定量,(3)切除pEntry-Surp-GFP-shRNA中的shRNA;連接目的基因;通過T4連接酶的作用,將合成好的shRNA927,shRNA485,shRNA2377分別連接到pEntry-Surp-GFP載體上。將構建好的pEntry-Surp-GFP-shRNA通過gateway試劑盒重組腺病毒質粒Ad.Surp-GFP-
6、shRNA,產物轉化TOP10感受態(tài)細菌,卡那霉素,LB平板,每個板挑選三個陽性克隆搖菌過夜培養(yǎng)。提取質粒,PacⅠ酶切鑒定重組pAd-Surp-shRNA構建成功,提取質粒測量質粒濃度為A260/A280=1.8032;A260/A280=t.8230; A260/A280=1.7104如圖1.1所示,送公司測序,結果正確。PacⅠ酶切后鑒定,重組子酶切顯示兩條切割帶分子量大小與酶切大小符合。通過gateway重組陽性的 pAd.su
7、rp-GFP-shRNA972,pAd.surp-GFP-shRNA485,pAd.surp-GFP-shRNA2377質粒在293A細胞中包裝Ad.Surp-GFP-shRNA,Ad.surp-GFP-shRNA轉染到293A細胞,8d收集細胞,離心,2 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,反復凍融,離心收集上清液,此為低滴度的病毒原液Ad.Surp-shRNA,取50%病毒原液反復感染293A,13000 rpm離心收集上清,通過流
8、式計算可得到高滴度腺病毒通過公式計算為7.01x10(^)10 TU/ml。
4、含Survivin啟動子重組的shRNA CD133基因重組的腺病毒對肝癌細胞株HepG-2體外作用的實驗研究;含Survivin啟動子的條件復制腺病毒Ad.surp-GFP-shRNA972,2377,485轉染肝癌細胞株HepG-2感染293T細胞作為對比,應用RT—PCR和Western blot檢測CD133mRNA和蛋白的表達;MTT法
9、和Transwell法檢測細胞體外增殖和侵襲能力,結果顯示,腺病毒972,2377,485能成功封閉CD133蛋白水平的表達;972,2377組能成功敲低CD133 mRNA的表達;MTT,Transwell檢測證實,實驗組細胞生長抑制和侵襲力都低于空白組,計算實驗組與空白組相比mRNA抑制率分別為(63.44±0.02)%,(56.98±0.03)%;972組,2377組,485組蛋白抑制率分別為(55.43±0.4)%,(48.65
10、±0.2)%,(34.67±0.4)%;實驗組細胞的增殖和侵襲能力也受到顯著抑制;972組抑制率為(72.88±0.74)%,2377組抑制率為(59.9±0.87)%,485組抑制率為(30.18±0.95)%。
結果:腫瘤特異性啟動子Survivin調控腺病毒介導的shRNA能顯著下調CD133基因的表達,抑制肝癌細胞株HepG-2的增值和減弱其侵襲力。
結論:腫瘤特異性啟動子survivin調控腺病毒介導的sh
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