卵巢特異性啟動(dòng)子OSP-2的克隆及其在順鉑化療中調(diào)控Survivin保護(hù)CHO細(xì)胞的研究.pdf

1、化療是目前腫瘤治療的主要方法之一，然而，化療藥物的細(xì)胞毒性在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還能對(duì)人體的正常組織也造成傷害，包括對(duì)女性生殖腺——卵巢的損傷?；熞鹇殉驳膿p傷包括卵巢功能紊亂、卵巢功能過(guò)早衰退和生殖能力下降等。已有研究顯示化療對(duì)卵巢的損害主要通過(guò)促進(jìn)卵巢細(xì)胞凋亡的機(jī)制。目前保存卵巢組織和功能的措施有藥物保護(hù)、胚胎冷凍保存、卵子冷凍保存、卵巢組織冷凍保存以及贈(zèng)卵。但是，現(xiàn)有的研究表明這些技術(shù)的效果并不盡如人意。隨著基因治療在腫瘤治療上取

2、得的進(jìn)展，我們也嘗試將基因治療運(yùn)用于卵巢組織的化療保護(hù)。在本研究中我們首次探索通過(guò)調(diào)控凋亡抑制基因在卵巢細(xì)胞中特異性表達(dá)減輕化療對(duì)卵巢的損傷的可行性。 第一章卵巢特異性啟動(dòng)子OSP—2的克隆與功能檢測(cè) 目的:通過(guò)分子克隆技術(shù)得到卵巢特異性啟動(dòng)子，并通過(guò)功能檢測(cè)驗(yàn)證其組織特異性；然后，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子序列的分析，初步探討卵巢特異性表達(dá)基因的調(diào)控機(jī)制。 方法: 1、分別提取卵巢組織基因組DNA和總RNA(tota

3、lRNA)； 2、依據(jù)卵巢特異性轉(zhuǎn)錄單位(ovarianspecifictranscriptionunits，OSTUs)序列的分析，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT—PCR自卵巢RNA中擴(kuò)增目的片段； 3、通過(guò)TA克隆對(duì)所獲得的片段進(jìn)行篩選，從中得到卵巢特異性啟動(dòng)子OSP—2； 4、通過(guò)雙酶切置OSP—2于質(zhì)粒pEGFP—C2中，取代原有CMV啟動(dòng)子，使綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GF

4、P)基因位于啟動(dòng)子OSP—2的調(diào)控之下；作為陽(yáng)性對(duì)照，OSP-1合成后依同法構(gòu)建重組載體pOSP-1-GFP；然后將所得的兩個(gè)重組載體轉(zhuǎn)染各種卵巢來(lái)源和非卵巢來(lái)源細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)； 5、同樣引物自卵巢基因組DNA中擴(kuò)增目的片段，并通過(guò)TA克隆進(jìn)行篩選，選取其中兩個(gè)與OSP-1和OSP—2相似度最高的片段，Mutant-1和Mutant—2，通過(guò)雙酶切構(gòu)建重組載體pMutant-1-GFP、pMuatnt—2-

5、GFP，然后將重組載體轉(zhuǎn)染各種卵巢來(lái)源和非卵巢來(lái)源細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)； 6、利用TFSEARCH軟件對(duì)OSP-1、OSP—2、Mutant-1、Mutant—2進(jìn)行序列分析，觀察啟動(dòng)子內(nèi)是否存在卵巢特異性順式作用元件及其變異是否與功能有關(guān)。 結(jié)果: 1、通過(guò)RT—PCR自卵巢RNA中擴(kuò)增得到507bp大小的片段，TA克隆單克隆化后得到卵巢特異性啟動(dòng)子OSP—2； 2、重組載體pOSP-1

6、-GFP、pOSP—2-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在卵巢來(lái)源細(xì)胞株CHO、HO—8910、OVCAR—3均見(jiàn)GFP的表達(dá)，而在非卵巢來(lái)源細(xì)胞株BRL、NRK中未見(jiàn)GFP的表達(dá)； 3、通過(guò)PCR自卵巢DNA中擴(kuò)增得到與OSP—2同樣大小的片段，TA克隆后獲得若干與OSP-1、OSP—2高度相似的序列，選擇兩個(gè)相似度最高的片段構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在卵巢來(lái)源還是非卵巢來(lái)源細(xì)胞均未見(jiàn)GFP的表達(dá)； 4、TFSEARCH軟件

7、分析顯示，啟動(dòng)子序列內(nèi)包含若干與卵巢生理相關(guān)的特異性順式作用元件，如雌激素反應(yīng)元件ER；在OSP-1和OSP—2內(nèi)這些順式作用元件未見(jiàn)突變，而在Mutant-1和Mutnat—2及其它自DNA中提取的片段內(nèi)則見(jiàn)到大量發(fā)生在特異性順式作用元件內(nèi)和/或其鄰近部位的突變。 結(jié)論: 1、利用分子克隆技術(shù)從OSTUs這一EST(expressedsequencetag，表達(dá)序列標(biāo)簽)中分離得到一個(gè)LRT(longterminalr

8、epeat，長(zhǎng)末端重復(fù)序列)樣序列，功能分析表明該序列具有卵巢特異性啟動(dòng)子功能，由于該序列與先前已知的OSP-1具有同源性，因此命名為OSP—2； 2、序列比較顯示OSP—2與克隆自大鼠基因組DNA的其它LRT樣序列可能來(lái)源于同一或相近的祖先，進(jìn)化過(guò)程中不同的堿基突變導(dǎo)致了不同的結(jié)局：OSP—2的啟動(dòng)子功能得以保存并獲得了卵巢特異性，其余序列則功能丟失，成為JUNKDNA； 3、對(duì)OSP—2、OSP-1以及JUNKDNA

9、中的兩個(gè)成員Mutnat-1、Mutant—2的分析表明OSP—2中存在一些特異性順式作用元件(如ER)，這些元件對(duì)維持OSP—2的卵巢特異性啟動(dòng)子功能具有決定性意義，其內(nèi)和/或鄰近部位的突變將導(dǎo)致功能的缺失； 4、OSP—2的克隆為進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交等技術(shù)釣取與之特異性結(jié)合的蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究卵巢特異性基因表達(dá)調(diào)控提供了線索；另一方面，由于OSP—2功能的卵巢特異性，OSP—2有可能成為卵巢基因治療和轉(zhuǎn)

10、基因動(dòng)物模型的制備中又一得力工具。 第二章OSP—2調(diào)控Survivin在順鉑化療中保護(hù)CHO細(xì)胞的研究 目的：利用OSP—2驅(qū)動(dòng)凋亡抑制基因survivin在CHO細(xì)胞特異性表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中探索將基因治療手段運(yùn)用于卵巢組織的化療保護(hù)的可行性。 方法: 1、通過(guò)酶連酶切反應(yīng)構(gòu)建重組載體pOSP—2-Survivin—GFP，使survivin—GFP融合蛋白直接位于卵巢特異性啟動(dòng)子OSP—2的調(diào)控之下；

11、 2、重組載體pOSP—2-Survivin—GFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得單細(xì)胞克隆，經(jīng)GFP檢測(cè)和survivin免疫組化驗(yàn)證，獲得穩(wěn)定表達(dá)survivin重組蛋白的CHO細(xì)胞克隆； 3、分別給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞常規(guī)治療劑量的順鉑化療，通過(guò)CCK8法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果: 1、經(jīng)G418篩選獲得若干單細(xì)胞克隆，挑取單克隆分別培養(yǎng)后行熒光顯微

12、鏡下GFP檢測(cè)和survivin免疫組化驗(yàn)證，獲得了穩(wěn)定表達(dá)survivin重組蛋白的CHO細(xì)胞克??； 2、給予常規(guī)治療劑量的順鉑化療后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，然而，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的下降趨勢(shì)明顯緩于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在細(xì)胞凋亡的檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率的下降趨勢(shì)明顯緩于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 結(jié)論: 1、OSP—2能夠驅(qū)動(dòng)凋亡抑制基因survivin在卵巢來(lái)源細(xì)胞特異性表達(dá)； 2、首次成功將s