CXCL14-GM-CSF酵母表達(dá)融合蛋白的制備和純化.pdf

1、細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞(如單核-吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成,分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì),作為細(xì)胞間信號傳遞分子,主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育,介導(dǎo)炎癥反應(yīng),刺激造血功能并參與組織修復(fù)等,按其主要功能可分為白細(xì)胞介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon,IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis f

2、actor.TNF)、集落刺激因子(colonystimulating factor,CSF)、生長因子(growth factor,GF)和趨化性細(xì)胞因子(chemokines)六大類.細(xì)胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)是當(dāng)今免疫學(xué)研究的一個熱點(diǎn)問題,利用基因工程方法將兩種或多種細(xì)胞因子融合在一起,是基于這些細(xì)胞因子具有相同或相關(guān)的功能活性,而各自作用靶點(diǎn)不同,其融合基因表達(dá)產(chǎn)物既具有其組成因子獨(dú)特的生

3、物學(xué)活性,還可能會通過生物學(xué)活性的互補(bǔ)及協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮出較單一細(xì)胞因子更佳的生物學(xué)活性.迄今為止,國內(nèi)外學(xué)者都已經(jīng)在該方面開展了深入的研究,構(gòu)建了多種融合蛋白,其中一些細(xì)胞因子融合蛋白如胰島素樣生長因子-Ⅱ和白介素-3(IGF-Ⅱ/IL-3)的融合蛋白因表現(xiàn)出良好的生物學(xué)功能而顯現(xiàn)出誘人的臨床應(yīng)用前景<'[1]>. CXCL14是第二軍醫(yī)大學(xué)免疫研究所從人DC的cDNA文庫中克隆得到的一個新的CXC類趨化因子,與趨化因子MIP-2

4、a、MIP-2B高度同源,但不含ELR基序(Glu-Leu-Arg),故將其命名為1,型巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(macrophage inflammatoryprotein-2 gamma MIP-2γ),<'[2]>現(xiàn)國際統(tǒng)一命名為CXCI14.以往的研究工作初步證明該新型趨化因子不僅對中性粒細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞等造血與免疫細(xì)胞具有定向趨化作用,而且還具有一定的造血調(diào)控活性,體外集落形成試驗(yàn)表明,該新型趨化因子可與多種造

5、血生長因子協(xié)同,促進(jìn)骨髓系及巨核系前體細(xì)胞的增殖及分化.GM-CSF是目前已知的一種具有廣泛生物學(xué)活性的造血生長因子,主要由活化T細(xì)胞、活化巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,可以刺激造血祖細(xì)胞和急、慢性髓樣白血病細(xì)胞增殖;促進(jìn)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增殖分化,增強(qiáng)它們殺菌、抗寄生蟲及抗腫瘤作用;增強(qiáng)粒細(xì)胞吞噬活性并上調(diào)其黏附分子表達(dá);促進(jìn)單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子;趨化粒細(xì)胞及單核細(xì)胞.最近研究表明:GM-CSF不僅是維持樹突狀細(xì)胞(

6、dendritic cell,DC)活性,促進(jìn)DC在體外分化、發(fā)育必需的細(xì)胞因子,而且在增強(qiáng)DC抗原遞呈功能和刺激T細(xì)胞增殖能力方面起關(guān)鍵性作用,臨床上可用于感染性疾病及惡性腫瘤的免疫治療<'[3,4,5]>.可見CXCL14與GM-CSF的生物學(xué)功能具有一定的互補(bǔ)性,若將兩者結(jié)合到一起制成具有各自生物學(xué)活性的融合蛋白,則該蛋白可能發(fā)揮先將免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞"趨化和聚集",然后再"激活和增強(qiáng)"這些免疫造血細(xì)胞的功能.推測該融合蛋白可能會

7、具有比單一細(xì)胞因子更好的生物學(xué)功能,有望成為一種在造血調(diào)控及抗腫瘤免疫中具有更佳生物學(xué)活性的新型細(xì)胞因子.另外,CXCL14作為一種新型趨化因子,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、受體、作用機(jī)制、信號傳導(dǎo)途徑還有諸多未解之處,構(gòu)建制備hCXCL14/hGM-CSF融合蛋白并研究其相關(guān)功能和機(jī)理,也有助于我們深入揭示CXCL14的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制. 目的： 構(gòu)建hCXCL14/hGM-CSF融合基因的酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K-hCX

8、CL14/hGM-CSF,并在畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中表達(dá),篩選出hCXCL14/hGM-CSF融合基因多拷貝串聯(lián)整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化菌株,然后優(yōu)化表達(dá)條件,最后經(jīng)過發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)表達(dá),獲得具有hCXCL14和hGM-CSF雙重活性的融合蛋白,并純化該融合蛋白. 方法： 1.利用分子生物工程技術(shù),用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶從重組pcDNA3.1(+)-hCXCL14/hGM-C

9、SF質(zhì)粒上雙酶切下hCXCL14/hGM-CSF融合基因的cDNA片段并插到酵母穿梭載體pPIC9K上,經(jīng)序列測定正確后,陽性重組質(zhì)粒pPIC9K-hCXCL14/hGM-CSF經(jīng)SalI酶線性化后,電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)表型篩選和G418抗性篩選后,對hCXCL14/hGM-CSF融合基因高拷貝串聯(lián)整合的酵母表達(dá)菌株進(jìn)行PCR鑒定. 2.將酵母菌株按不同的條件進(jìn)行培養(yǎng),用R&D公司的人GM-CSF定量ELI

10、SA檢測試劑盒檢測OD<,450>值,快速定量檢測工程菌表達(dá)上清中的GM-CSF濃度,據(jù)此來判定相應(yīng)融合蛋白的含量,并采用分光光度計測定酵母菌培養(yǎng)液光密度OD<,600>值,兩方面結(jié)合確定最佳表達(dá)條件.優(yōu)化表達(dá)的條件包括培養(yǎng)基(BMMY,BMGY,BMM,YPD和MM),溶解氧濃度(50﹪,60﹪,70﹪,80﹪,90﹪),培養(yǎng)時間(24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h,),甲醇誘導(dǎo)濃度(0.05﹪,0.075﹪,0.

11、1﹪,0.15﹪,0.3﹪).SDS-PAGE和Western blot分析鑒定融合蛋白的表達(dá). 3.發(fā)酵上清液經(jīng)50﹪飽和硫酸銨鹽析,50mM PBS(PH7.4)透析,經(jīng)Hiprep16/10 Souce30Q柱陰離子層析和Sephasdex G200柱分子篩層析后得到純化hCXCL14/hGM-CSF融合蛋白,并利用HPLC系統(tǒng)對其純度進(jìn)行分析. 結(jié)果： 1.成功得到了酵母重組質(zhì)粒pPIC9K-hCXCL1

12、4/hGM-CSF,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)表型篩選和G418濃度梯度篩選及PCR鑒定得到hCXCL14/hGM-CSF融合基因高拷貝串聯(lián)整合的His<'+> Mut<'+>重組酵母菌株. 2.重組酵母菌株經(jīng)過發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)后,表達(dá)出相對分子質(zhì)量約為50kD左右,具有抗hCXCL14和抗hGM-CSF雙抗原性的融合蛋白. 3.將酵母菌株GS115/pPIC9K-hCXCL14/hGM-CSF的表達(dá)條件進(jìn)行

13、了優(yōu)化,結(jié)果顯示:表達(dá)該酵母工程菌的最佳培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基,溶解氧和甲醇誘導(dǎo)濃度分別為80﹪～90﹪和0.1﹪,最適誘導(dǎo)表達(dá)時間為72h.酵母發(fā)酵上清液經(jīng)50﹪的飽和硫酸銨鹽析,50mM PBS(PH7.4)透析,Hiprep16/10 Souce30Q柱陰離子層析和Sephasdex G200柱分子篩層析后,HPLC系統(tǒng)分析hCXCL14/hGM-CSF融合蛋白的純度達(dá)95﹪左右. 結(jié)論： 得到了重組酵母表達(dá)質(zhì)粒p